Proizvodnja bioloških leč in laserjev za izboljšave v mikroskopiji
iGEM 2016 team TU Delft: Opticoli - Producing biological lenses and lasers using synthetic biology [1].
Uvod
Projekt nizozemske iGEM ekipe, Opticoli, preko sintezne biologije povezuje navidez nezdružljive elemente, E. coli, laserje in leče s ciljem izboljšati detekcijo pri fluorescenčni mikroskopiji. Prvi način za izboljšanje detekcije v mikroskopiji je povečanje emisije fotonov. To dosežemo, če povečamo delež vzbujenih fotonov pri enaki koncentraciji fluoroforjev. Konceptualno tako delujejo laserji. Obenem želimo, da čim večji del vzbujenih fotonov, prispe do detektorja, zato si prizadevamo energijo fotonov usmeriti oz. sfokusirati v snop svetlobe, kakor to počnejo leče. Namen projekta Optikoli je bil s pomočjo sintezne biologije spremeniti E.coli na način, da bodo delovale kot leče oz. laserji, torej priprava bioleč in biolaserjev.
Biolaser
Za pripravo biolaserja je potrebno razumeti delovanje in sestavo laserja ter to prenesti v biološki kontekst. Glavni sestavni deli laserja so: medij z fluoroforji, vir za ekscitacijo fluoroforjev in refraktivni element (ogledala). Vir za ekscitacijo zagotovi ustrezno energijo za vzbujanje fluoroforjev, ki energijo relaksirajo tako, da izsevajo foton. Zaradi ogledal se lahko izsevani foton odbije nazaj v medij in vpliva na že ekscitiran fluorofor. To rezultira v amplifikaciji emisije, fenomenu, ki mu pravimo stimulirana emisija in ga je leta 1917 prvi opisal A. Einstein. Pri fiksni koncentraciji flourescenčnih molekul laser zaradi stimulirane emisije generira bistveno več svetlobe, kot običajna fluorescenca. V biološkem laserju lahko vlogo flouroforjev prevzamejo fluorescenčni proteini, npr. GFP. Vir ekscitacije je svetloba ustrezne jakosti. Malce več domišljije pa zahteva vzpostavitev ogledal. Biološka alternativa ogledalom so polisilikati, ki nastanejo s polimerizacijo silicijeve kisline, ki jo katalizira encim silikatein. Z biološkimi alternativami za sestavne dele laserja so lahko zasnovali biolaser.
Bioleče
Naloga leč je sfokusirati svetlobo, da ta v največji meri pride do detektorja. Problem konvencionalnih leč je zahtevna in okolju neprijazna proizvodnja, povrhu vsega pa so tudi zelo drage. Biološka alternativa tem lečam bi lahko bile bakteije E.coli obdane s polisilikatnim ovojem, ki bi jih pripravili podobno kot biolaserje.
Eksperimenti in rezultati
Analiza silikatnega ovoja okrog celic
Polisilikatni ovoj, ki deluje kot nekakšno biološko steklo je ključen zato, da E.coli delujejo kot biolaser ali bioleče saj omogoča odbijanje in fokusiranje fotonov. Pripravo tega polisilikatnega ovoja omogoča encim silikatein, ki polimerizira silicijevo kislino. Silikatein iz spužv so izrazili v E.coli BL21 kot fuzijski protein z OmpA signalnim zaporedjem, ki zagotovi, da se silikatein izrazi na zunanji membrani E.coli. Zapis z OmpA sekrecijskim peptidom so vstavili pod Lac promotor, ki je omogočal inducibilno izražanje fuzijskega proteina ob dodatku IPTG. Za ovrednotenje polisilikatnega ovoja so najprej naredili test z rodaminom 123. Pri dodatku tega barvila direktno v gojišče se to barvilo specifično veže na polisilkate in se tam zadrži po spiranju celic s PBS. Fluorescenčni posnetki barvanja z rodaminom 123 so potrdili, da se njihova biokocka izraža v BL21 sevu E.coli in da je silikatein učinkovito polimeriziral monosilikate v polisilikate na površini celic. Obstoj polisilikatnega ovoja okrog E. Coli so prav tako potrdli s SEM, TEM in AFM. Pri TEM so celice, ki so izražale OmpA-silikatein in so bile inducirane z silicijevo kislino in negativno kontrolo (OmpA-silikatein transformirane celice brez silicijeve kisline) fiksirali na grafitne mrežice posneli z HAAFD-TEM in energijsko disperzivno X-spektroskopijo (EDX) za elementno določitev. Z EDX so potrdili, da so inducirane celice obdane s silicijem. Dodatno so z atomsko mikroskopijo (AFM) pokazali, da so celice, inducirane s silicijevo kislino bolj toge kot neiducirane, kar kaže na to, da so obdane s polisilikatnim slojem.
Izdelava mikroskopa za karakterizacijo biolaserja
Priprava biološkega laserja je poleg načrtovanja biokock zahtevala tudi izdelavo prilagojene optične opreme, ki omogoča nastanek in zaznavanje laserske svetlobe. Lasersko svetlobo namreč lahko vzbudimo in opazimo samo, če v vzorcu pride do populacijske inverzije, to je stanja, ko je v vzorcu večina fluoroforjev ekscitiranih. Zato je ekipa TU Delft sestavila poseben mikroskop, ki za ekscitacijo uporablja laser s pulznim delovanjem. Laser je močan vir fotonov za vzbujanje velikega števila molekul, pulzna regulacija laserja pa prepreči efekt fotobledenja. Za detekcijo emisije laserske svetlobe so mikroskop opremili z 50x objektivom in inventio III CCD kamero. Mikroskop se je pri testiranju izkazal za funkcionalnega zato so ga uporabili za analizo njihovega biolaserja.
Analiza delovanja biolaserja
Biolaser so predstavljale celice E.coli ovite s silikatnim ovojem in transformirane s fluorescenčnim proteinom mCerulean. Kot kontrolo so uporabili celice, ki so izražale samo mCerulean in celice, ki so bile obdane s silikatim ovojem. Za potrditev delovanja biolaserja je bilo ključno, da se emitirano svetlobo mCerulean okarakterizira kot lasersko in loči od običajne fluorescence. Za obe je značilno, da intenziteta svetlobe narašča linearno z energijo ekscitacije. Vendar se pri pojavu laserske svetlobe pri določeni energije ekscitacije doseže prag, kar izzove stimulirano emisija. Tudi za stimulirano emisijo je značilna linearna odvisnost intenzitete svetlobe od energije ekscitacije, a je ta mnogo bolj strma od običajne. Biolaser so analizirali tako, da so modificirane celice E.coli obsevali z različnimi energijami ekscitacije (0.1 - 10 mW) in merili intenziteto emitirane svetlobe pri 405 nm. Z imageJ so nato analizirali slike, da so določili intenzitete emitirane svetlobe pri posameznih energijah ekscitacije. Ugotovili so, da njihov biolaser ne oddaja laserske svetlobe. Intenziteta svetlobe mCerulean je linearno naraščala le do vrednosti 1 mW. Nad ekscitacijsko močjo 2mW se intenziteta fluorescence ni več spreminjala, kar predvidevajo, da je posledica fotobledenja. Vseeno bi v primeru delovanja biolaserja lasersko svetlobo morali opaziti pri energijah ekscitacije pod 1mW, kjer še ni bilo efekta fotobledenja. Neuspeh bi lahko bil posledica ne dovolj občutljivega sistema za detekcijo. Vendar je bolj verjetna njihova ugotovitev, da je E.coli neprimeren model za laser, ker je velikost celice (1 µm) premajhna za pojav laserske svetlobe pri koncentracijah fluoroforja 20 mM. Z modeliranjem so pokazali, da bi pri takšnih koncentracijah potrebovali vsaj 10x večje celice (npr. sesalske celice.
Analiza delovanja bioleč
S polisilikatnim ovojem obdane E.coli so delovale kot mikroleče. Večina svetlobe je prehajala skozi bioleče in se je fokusirala približno 1 µm za celico. Ta fokalna točka je bila dejansko razširjena in je obsegala regijo med 0.5-1.5 µm za celico. AFM so pokazali da polisilikatni ovoj vpliva na togost celic, ne pa tudi na njihovo obliko. Za aplikacijo bioleč je potrebno zagotoviti, da bodo s polisikati enkapsulirane celice kar se da homogene glede oblike. Zato so E.coli dodatno transformirali z genom BolA, ki vpliva na sferično obliko celic. Sferična oblika leč je boljša kot paličasta oblika E.coli, ker nima orientacijskega vpliva na optične lastnosti leč. Vpliv izražanja BolA na obliko celic so preverili s SEM. Pred realno uporabo bioleč izven laboratorijev so raziskali tudi najoptimalnejši in nedestruktiven (kar se tiče oblike) način za sterelizacijo bioleč. Sterilizirane bioleče so nato testirali za učinkovitost pri zbiranju svetlobe na sončnih celicah. Zaradi uporabe bioleč, bi moralo na sončne celice pasti več fotonov, posledično bi te morale proizvesti več energije.
Vpliv bioleč na učinkovitost sončnih celic
Učinkovitost sončnih celic se določi z PCE (power conversion efficiency), to je energija, ki jo sončne celice sproducirajo pri fiksni količini svetlobe. S pomočjo Xe-žarnice z definirano svetlobno močjo so izmerili učinkovitost sončnih celic in določili kako se ta spremeni pri uporabi njihovih bioleč. Čeprav so pričakovali, da bodo z uporabo bioleč izboljšali učinkovitost sončnih celic, se PCE ob uporabi njihovega produkta ni povečal. To razlagajo z eksperimentalnimi nastavitvami. Pri merjenju PCE so imeli bioleče fiksirane na steklo, ki ima drugačen lomni količnik in vpliva na fokusiranje žarkov. Z dodatnimi eksperimenti so ugotovili, da fokalno območje njihove bioleče leži 1 µm stran od celice, kar pomeni, da bioleča optimalno deluje, če leži 1 µm nad sončnimi celicami. Nadalnja optimizacija njihovih bioleč bo zato usmerjena v dizajn ustreznega optičnega vmesnika.
Zaključek
S projektom Optikoli iGEM skupina iz Delfta sicer ni uspela pripraviti funkcionalnih biolaserjev in bioleč ampak so pokazali zanimiv in teoretično dobro podprt sinteznobiološki pristop k uporabnemu produktu. To jim je prineslo nagrado za najboljši model na tekmovanju. V register biokock so prispevali nekaj čisto novih delov, med njimi je biokocka OmpA-silikatein prejela nagrado za najboljšo biokocko. Skupina je razvila uspešen mehanizem obdajanja celic s polisilikati in s tem napravila korak naprej k razvoju bioleč oz. biolaserjev. Bili so uspešni tudi pri sestavljanju svojega mikroskopa. Priprava biolaserjev iz bakterij E.coli ni uspela, ker je za celice tega velikostnega reda potrebna večja koncentracija fluoroforjev. V prihodnje nameravajo biolaser pripraviti iz večjih, sesalskih celic. Pri modeliranju bioleč jim je uspelo pripraviti skoraj povsem sferične E.coli, obdane s polisilikatnim ovojem. Njihove leče so bile zmožne fokusirati svetlobo, ampak ne v fokalni točki temveč v razširjenem fokalnem območju. Ta razširjena regija je glavna pomanjkljivost njihovih bioleč, ker morajo imeti leče za aplikacijo v kamerah zelo definirano fokalno točko z minimalnimi deviacijami. Trenutno zato pozornost posvečajo aplikacijam, kjer zahteve po fokalni točki niso bistvene. Njihove bioleče imajo zaenkrat potencial pri zbiranju svetlobe na sončnih celicah. Pred dejansko uporabo na sončnih celicah pa bodo morali razviti primeren optični vmesnik, da bo fokalno območje bioleč ravno na sončnih celicah. Glavna prednost njihovih bioleč je, da so 10 - 100x manjše od konvencionalnih mikroleč, kar pomeni da imajo boljšo kapaciteto fokusiranja svetlobe na nano-mikrometrske strukture. Druga očitna prednost bioleč pa je enostavna, za okolje manj obremenjujoča in poceni produkcija.
Viri
Spletna stran: http://2016.igem.org/Team:TU_Delft <references />
