Programiranje celic s ponavljajočim večmestnim modeliranjem genoma in pospešeno evolucijo

Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution

Kompleksnost živega sveta je zaradi stalne evolucije, ki organizmom omogoča prilagajanje na razlike v okolju, ogromna. V laboratorijskem merilu je raznolikost, primerljivo z naravno, težko doseči, saj oprema za tako obširno delo do l. 2009 še ni bila razvita. Preboj na tem področju je uspel raziskovalcem iz laboratorija G. M. Churcha, ki so razvili sistem za avtomatizirano programiranje celic s ponavljajočim večmestnim modeliranjem genoma in pospešeno evolucijo (MAGE, ang. Multiplex Automated Genome Engineering). Ta sistem omogoča hkratno spreminjanje številnih lokacij v genomu in tako ustvarja genomsko kombinatorično knjižnico, ki posnema naravno raznolikost. Na ta način je omogočeno usklajeno spreminjanje mnogih genov, udeleženih v proizvodni poti določene molekule. Ker je celoten proces izpostavljen pospešeni evoluciji pa se mutacije, ki bi se sicer izločile iz naravnega nabora zaradi selekcijskega pritiska, lahko sklopijo z drugimi in delujejo sinergistično ter ustvarijo fenotip, ki je uspešnejši od divjega tipa.

Uvod

Homologna rekombinacija je tip rekombinacije, kjer se enaki ali zelo podobni nukleotidni zaporedji izmenjata in tako npr. popravita napako, ki je nastala med procesom podvojevanja DNA, ali pa npr. doprinese k večji genetski pestrosti, če se to zgodi v spolnih celicah. Rekombiniring (na rekombinaciji temelječ genetski inženiring) je močno orodje, ki temelji na homologni rekombinaciji. V osnovi gre običajno za vnos sintetičnih fragmentov DNA, ki se zaradi homolognih koncev kondenzirajo s tarčami na genomu. Na ta način v tarčno zaporedje vnesejo mutacijo, ki je po svoji naravi lahko insercija, delecija ali pa se dolžina zaporedja ohrani in se le spremeni zaporedje baz. Po principu rekombiniringa deluje tudi MAGE in je prvi tovrsten poskus hkratnega spreminjanja večih lokacij v genomu. Za karakterizacijo MAGE so uporabili bakterijo Escherichia coli, sev EcNR2, uspešno alelno zamenjavo pa so dosegli z induciranim izražanjem proteina β iz bakteriofaga λ-Red. Gre za protein, ki veže enoverižne fragmente DNA in jih usmerja na zaostajajočo verigo replikacijskih vilic pri podvojevanju DNA.

Oligonukleotidi

Omenjeni enoverižni fragmenti DNA so v tem primeru sintetični oligonukleotidi, ki jih z elektroporacijo vnesejo v celice. V različnih presejalnih eksperimentih so se za optimalne izkazali oligi, dolžine 90 nukleotidov (nt), s štirimi fosforotioatnimi vezmi na 5'-koncu. Taka dolžina oligonukleotidov je primerna, ker je bilo ugotovljeno, da protein β potrebuje vsaj 30 nt dolgo verigo za tvorbo kompleksa in-vitro, in-vivo pa krajša sekvenca pomeni manjši odstotek homolognih baznih parov s tarčo na kromosomu in posledično slabšo uspešnost rekombinacije. Po drugi strani pa daljše sekvence kljub večjemu odstotku homologije kažejo tendenco do tvorbe sekundarnih struktur, ki lahko znatno zmanjšajo delež izpostavljenih baz in s tem verjetnost homologne rekombinacije. Skupaj s tem so raziskovalci ugotovili, da so sekvence, pri katerih je izračunana prosta Gibbsova energija zvite oblike nižja od -12,5 kcal/mol bistveno slabše za vnašanje modifikacij z rekombinacijo, kar se odlično sklada s prej napisanim. Štiri fosforotioatne vezi na 5'-koncu so se izkazale kot optimalne, saj preprečijo prehitro razgradnjo sintetičnih oligonukleotidov z endogenimi eksonukleazami in tako za dvakrat povečajo stopnjo homologne rekombinacije. Fosforotioatne vezi na 3'-koncu oligonukleotidov niso vplivale na njihovo stabilnost. V oligonukleotidih, kjer so bile vse vezi v verigi zamenjane s fosforotioatnimi pa do inkorporacije v kromosom ni prišlo.

Likopen

Likopen je močen antioksidant, prisoten pa je v nekaterih vrstah sadja rdeče barve (lubenica, paradižnik, papaja itd.). Obarvan je zaradi sistema konjugiranih vezi, zaradi česar je tudi potencialno učinkovit pri vezavi reaktivnih kisikovih zvrsti. Uvrščamo ga med karotenoide, a v telesu ne deluje kot vitamin A. Njegova zdravilna vloga sicer še ni bila nedvoumno dokazana.

Rezultati

Prototip MAGE

MAGE sestoji iz komore, kjer celice rastejo pri 30 °C. Ko kultura doseže pravo gostoto, kar stalno spremlja spektrofotometer pri 600 nm, se jo segreje na 42 °C, s čimer se inducira tvorba proteina β. Nato se celice ohladi na 4 °C, s čimer se prepreči razgradnja proteina β, temu pa sledi odstranitev medija in resuspendiranje celic v vodi. Celicam se nato doda mešanica sintetičnih oligonukleotidov, čemur sledi elektroporacija pri 18 kV/cm. Zaradi visoke napetosti pomre kar 95 % celic, ki tako poleg vnašanja DNA v celico služi tudi za redčenje populacije. Celicam se nato znova izmenja medij in začne se nov cikel. Kljub temu, da se v vsakem posameznem ciklu MAGE vnese le del vseh mutacij, pa lahko z večjim številom ciklov kumulativno dosežemo, da v knjižnico dobimo vse možne mutante, ne glede na velikost populacije. Platformo MAGE so že uporabili za ponovno kodiranje celotnega genoma E. coli, da bi uvedli nenaravne aminokisline in ustvarili sev odporen na različne viruse. Sistem omogoča tudi vnos kompleksnih razmer gojenja raznovrstnih organizmov in ekosistemov in tako odpira možnost izboljšav različnih sinteznih poti in celo celičnih linij. Na ta način bi lahko denimo naredili celične linije, ki bi jih bilo lažje transfecirati, ali pa take, v katerih bi lažje prišlo do alelne zamenjave.

Biosinteza likopena

Da bi prikazali praktični doprinos procesa MAGE, so raziskovalci optimizirali biosintezno pot likopena, v E. coli sevu EcHW2 s plazmidom pAC-LYC, ki je potreben za zadnje stopnje biosinteze likopena. V eksperimentu so ciljali dvajset endogenih genov, za katere je znano, da pozitivno vplivajo na količino sintetiziranega likopena. Za vsakega izmed njih so sintetizirali zalogo oligonukleotidov s homolognimi konci (30 nt na vsaki strani) in degeneriranim osrednjim delom zaporedja. Njihov cilj je bil vnesti veliko število mutacij v vezavno mesto za ribosom (RBS, ang. Ribosome Binding Site), da bi bilo to bolj podobno Shine-Dalgarnovem zaporedju (TAAGGAGGT). To bi imelo za posledico več translacije mRNA proteinov, udeleženih v sintezo likopena. Sintetizirani oligonukleotidi so imeli zaporedje DDRRRRRDDDD; D=A,G,T; R=A,G, kar je pri 20 genih kar 4,7 *10^5 različnih variant. Poleg tega so z uvedbo dveh stop kodonov v odprt bralni okvir utišali štiri gene iz sekundarnih poti, ki bi sicer zmanjševale končni izplen likopena. V nasprotju s prejšnjimi pristopi raziskovalcev, ki so bili omejeni na majhno število genov, ki so jih lahko manipulirali hkrati, so z MAGE sočasno vnašali mutacije v vseh 24 genov. V članku trdijo, da so naredili 15 milijard različnih genetskih variant v 35 ciklih MAGE. Različice, ki so najuspešneje proizvajale likopen so bile izbrane na podlagi količine rdečega pigmenta v izoliranih kolonijah. Najuspešnejše izmed njih pa so proizvajale kar petkrat več likopena kot starševski sev. MAGE omogoča visoko specifičnost kjer je ta zaželena, kar je bilo v opisanem članku uporabljeno pri uvajanju nesmiselnih mutacij v gene sekundarnih poti, kjer je bil cilj utišanje genov. Kjer pa je cilj uvesti raznolikost je ta pristop ravno tako uporaben, saj lahko z različnimi oligonukleotidi na specifično mesto v genomu uvedemo spekter mutacij v celotni populaciji, kar je odlična predispozicija za sledeče presejalne teste.

Zaključek

S prihodom sekvenciranja nove generacije, je naša zmožnost branja genomov močno presegla zmožnost spreminjanja teh. Z razvojem tehnik kot je MAGE, ki omogoča visoko učinkovito in specifično tarčenje in avtomatizirano delovanje se ta razkorak med zmožnostmi gotovo zmanjšuje. MAGE omogoča simultano vnašanje mutacij v različna mesta v genomu, s čimer se odpira možnost izboljševanja sinteznih poti in tudi samih celičnih linij, s čimer pripomore tako pri zmanjševanju cene industrijske biosinteze kot tudi omogoča nadaljnji napredek v znanosti.