Vodni medvedki in reševanje proteinov
Genspace 2016: vodni medvedki lahko ščitijo proteine in cepiva [1]
UVOD
Ameriška ekipa, imenovana Genspace, si je za sodelovanje na tekmovanju IGEM izbrala precej zanimiv projekt, saj je le-ta vključeval mnogim nepoznano skupino bitij – t.i. »medvedke«. Medvedki, počasniki ali s taksonomskim imenom tardigradi so mikroskopsko majhne živali, ki so svoje ime dobili po vzorcu gibanja, ki spominja na motoriko medvedov. Imajo dvobočno somerno in členjeno telo z osmimi nožicami, ki doseže do 1,5 mm velikosti, evolucijsko pa so najbolj sorodni členonožcem, krempljičarjem in glistam. Kar jih naredi tako posebne, je njihova lastnost kriptobioze; z dehidracijo so namreč sposobni preživeti najbolj ekstremne življenjske pogoje (od ekstremno nizkih do ekstremno visokih temperatur, ekstremno visok tlak, izsušitev, neznatno količino sevanja ipd). Ideja ekipe Genspace je torej bila, da bi to lastnost prenesli na druge organizme in s tem omogočili večjo stabilnost proteinov in raznih cepiv, kar bi pripomoglo k varnejši logistiki in shranjevanju terapevtikov, cepiv in mikrobioloških kultur.
PROJEKT
1.DEL: Prenos IDP proteinov v kulturo E.coli
Prehod medvedkov v stanje kriptobioze se pripisuje skupini proteinov, poimenovanih IDP oziroma t.i. intrinzično neurejeni proteini. Ti proteini v vodnem okolju nimajo obstojne terciarne strukture, zavzamejo jo namreč šele v pogojih dehidracije. Zaradi teh karakteristik je predpostavljeno, da IDP proteini preprečujejo agregacijo proteinov in s tem povezan propad celičnih komponent med izsušitvijo. V literaturi je bilo pri glistah in rastlinah pokazano, da podskupina IDP proteinov - proteini LEA (late embryogenesis abundant), kateri se, kot ime pove, izražajo v pozni fazi razvoja embria, preprečuje negativne posledice dehidracije. Ekipa Genspace je za izražanje v E.coli izbrala tri IDP proteine, in sicer AavLEA1, katerega ime izhaja iz izvornega organizma Aphalenchus avenae, ter RVLEAM in MAHS, katera sta protektanta v tardigradih vrste Ramazzottius varieornatus. Poleg tega je ekipa za svoj eksperiment s kulturami bakterij poiskala še 3 gene, ki v tardigradu vrste Hypsibius dujardini, kodirajo vsak za svoj IDP protein. Ti trije geni pripadajo različnim gručam, a so najdeni pri velikem številu vrst tardigradov. Pripisali so jim imena HDLEA1, HDLEA2 in HDLEA3. Eksperiment: Cilj ekipe Genspace je bilo preveriti, če izbrani IDP proteini, izraženi v drugih organizmih, natančneje v bakterijskih kulturah E.coli, ohranjajo integriteto bioloških produktov in doprinesejo k preživetju. To naj bi IDP proteini bili zmožni doseči preko zavzetja vloge šaperonov, ki bi se aktivirali v hiperosmotskih pogojih, ali pa preko popravljanja DNA po rehidraciji. Ekipa je izmed šestih izbranih kandidatnih IDP proteinov izbrala HDLEA1, s pomočjo IDT (Integrated DNA Technologies) uspešno sintetizirala gen, ki ga kodira, in ga z molekulskim kloniranjem vnesla v plazmid pSB1C3. Z metodo Colony PCR so potrdili prisotnost vnesenega zapisa. Člani ekipe so prav tako zasnovali protokol, s katerim bi okarakterizirali in kvantificirali vpliv vnosa zapisa za HDLEA1 na preživetje bakterijskih kolonij. Le-ta je baziral na enostavni primerjavi preko nočne kulture E.coli (ki je služila kot kontrolna skupina) brez vnesenega zapisa za HDLEA1 po postopku izsušitve in kulture, ki je imela vnesen zapis za HDLEA1. 20 mikrolitrov omenjene preko nočne kulture so nanesli na parafilm, dodatnih 20 mikrolitrov pa na plošče z gojiščem. Kulturo na parafilmu so nato podvrgli izsušitvi na 37° C za določen inkubacijski čas, medtem ko so kulture na ploščah inkubirali po postopku za štetje kolonij - CFU (colony forming units). Po določenem času inkubacije so kulture na parafilmu resuspendirali v tekočini in jih prenesli na plošče z gojiščem, da so tvorile kolonije. Z metodo štetja CFU so nato prešteli kolonije tudi tem kulturam in primerjali vrednosti CFU brez postopka izsušitve z vrednostjo po postopku izsušitve. Protokol so tako za skupino brez vnesenega zapisa za HDLEA1 kot tudi za skupino z zapisom za HDLEA1 izvedli v treh paralelkah, da so zagotovili bolj reprezentativno stanje v smislu ponovljivosti ter večjo statistično moč.
Kot je vidno na grafu rezultata opisanega protokola, so bili inkubacijski časi določeni na 0, 4, 7 in 22˙5 ur. Obe prikazani krivulji precej jasno demonstrirata pričakovano stanje po protokolu; kolonije z izraženim HDLEA1 so imele višjo stopnjo preživetja v primerjavi z ostalimi. V vsakem primeru pa preživetje vseh kultur upada z daljšanjem časa izpostavljenosti izsušitvi. Opazi se tudi, da kolonije z HDLEA1 izrazito bolje prenesejo pogoje izsušitve glede na referenčne pri trajanju izpostavljenosti izsušitvi nad 4 urami; faktor preživetja skupine HDLEA1 je namreč 3,2-krat višji pri 7 urah izsušitve in 2,5-krat višji pri 22˙5 urah izsušitve v primerjavi z referenčno skupino. Le-to potrjuje pozitiven učinek vnosa zapisa za HDLEA1 v bakterijske kulture. Ekipa je identičen protokol izvedla tudi s kandidatnim IDP proteinom MAHS, vendar le-ta ni bil tako uspešen, saj se rezultati že pri 7 urah izsušitve ne ujemajo s pričakovanimi. Zatorej ni bilo moč pokazati, da ima izražanje IDP proteina MAHS pozitiven vpliv na preživetje bakterij.
2.DEL: uporaba tardigradov kot modelni organizem za razvoj
Čeprav se na področjih genetike, biologije in v vsem njima sorodnih disciplinah uporablja že uveljavljen nabor modelnih organizmov za študij razvoja, kamor tipično sodita D.melanogaster in C.elegans, je ekipa Genspace vseeno želela poiskati in pokazati karakteristike, ki bi tudi skupino tardigradov uvrstila v ta nabor. Po njihovem mnenju bi prej opisane unikatne lastnosti vodnih medvedkov v primerjavi z prej omenjenima modelnim organizmoma prikazala do sedaj še neidentificirane evolucijske povezave glede na diferenčno izražanje genov tekom razvoja. Ekipa je želela z metodo izbijanja genov razviti fenotip tardigradov iz vrste Hypsibius duardini ( to je edina vrsta Tardigradov, katere genom je v celoti poznan), v katerem se ne bi izražala 2 določena gena. Ta 2 gena so določili glede na zasnovo eksperimenta in rezultate študije avtorja Tenlen, kateri se je ukvarjal z identično tematiko, in sicer sta bila to gen za aktin-1 in ter gen za mago nashi. Člani ekipe so se oprli ravno na to študijo in ta dva gena, ker je bil v njej že opisan tako eksperimentalni pristop kot tudi pričakovani fenotip, katerega so seveda želeli ponoviti, da bi pokazali vpliv izbitega gena. Eksperiment: Za samo izbijanje genov se je ekipa odločila uporabiti tehnologijo CRISPR/Cas. Ker pa v literaturi CRISPR protokol še nikoli ni bil uporabljen v tem taksonomskem deblu, je ekipa za zgled poiskala protokole, ki so bili do sedaj uporabljeni pri omenjenima D.melanogaster in C.elegans, saj sta obe vrsti pripadnici taksonomsko najbolj sorodnima debloma. Pri obeh omenjenih vrstah je bila dokumentirana uporaba mikro injiciranja kompleksa Cas9 in sgRNA, in ravno tega pristopa so se poslužili tudi člani Genspace. Za oba prej navedena izbrana gena so zasnovali in naročili gRNA molekule, za samo izvedbo celotnega eksperimenta pa so pripravili zelo natančen protokol. Vodne medvedke so previdno tretirali s posebnim zaporedjem menjave medijev ter dodatkom anestetika. Ločeno so pripravili Cas9 ter gRNA v raztopini ter ju zatem pripravili tako, da so se tvorili kompleksi Cas9-gRNA. Raztopino s pripravljenimi kompleksi so nato vnesli v igle in jo injicirali v gonade medvedkov. Medvedke so nato prenesli nazaj v njihov naravni medij. Na žalost kljub uspešnemu mikro injiciranju eksperiment ni uspel, saj posega ni preživel niti eden od uporabljenih vodnih medvedkov. Zaključek tega eksperimenta lahko torej podaja smernice za bodoče eksperimente mikro injiciranj tardigradov, in sicer predvsem v smislu same tehnike vnosa ter uporabljenega pritiska pri injiciranju, koncentracije nukleaze Cas9 in specifičnega tarčnega mesta na telesu medvedka (lahko da je bil vnos ravno v gonade tisti faktor, ki je povzročil smrt). Na vseh teh točkah je namreč možnih precej variacij, ki bi lahko vodile v uspešne eksperimente in pozitivne rezultate.
3.DEL: meritev števila kopij plazmida pSB1C3
Stranski projekt ekipe pa je bil razvoj metode kvantifikacije za število kopij plazmida pSB1C3, ki bi potrdil do sedaj le predvideno število kopij v sevu 10 bakterij E.coli. Različni viri namreč podajajo različne vrednosti kopij plazmida v intervalu 100-300 kopij na celico. Ekipa Genspace pa je prva razvila qPCR metodo, ki natančno potrdi število kopij plazmida (PCN), in jo uporabila za prve meritve. Za ta projekt so prejeli nagrado Measurment award.
