Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice
A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells
Uvod
Zdravljenje raka je nenehno razvijajoče se področje. Študije so pokazale povezavo med avtoprotitelesi in faktorjem komplementa H (CFH) pri pacientih z zgodnjim stadijem nedrobnoceličnega pljučnega karcinoma. V predstavljeni raziskavi so znanstveniki preučevali imunski odziv pri skupini pacientov z zgodnjim stadijem raka, kjer se metastaze še niso razvile. Cilj študije je bila identifikacija specifičnih protiteles, ki so sposobna prepoznati tumorske celice ter sprožiti njihovo smrt. V ta namen so izolirali in okarakterizirali človeška protitelesa proti CFH, ki so jih pridobili iz spominskih B celic pacientov z avtoprotitelesi.
CFH je regulatorni protein, ki ščiti celice pred napadom sistema komplementa in zavaruje celice pred celično lizo. To izkoristijo tumorske celice, da se izognejo uničenju s strani sistema komplementa. V omenjeni raziskavi so predvideli, da pacientova protitelesa proti CFH nevtralizirajo protein CFH. Tako omogočijo aktivacijo komplementa in tumorsko celično lizo, pri kateri se sprostijo peptidi komplementa (C3a, C4a in C5a), ki modulirajo pridobljeni imunski odziv. Celotni proces povzroči zaviranje rasti tumorjev in preprečuje metastaziranje.
Rezultati in diskusija
Izolacija človeških protiteles proti CFH iz pacientov z avtoprotitelesi
Najprej so enajstim pacientom, ki so izražali avtoprotitelesa proti CFH, odvzeli periferne enojedrne krvne celice. S pretočnim citometrom in peptidom iz CFH, ki je deloval kot vaba in vseboval zaporedje epitopa, so zbrali spominske B celice, ki so izražale protitelesa proti želenem epitopu. Genske segmente variabilnih delov lahke (VL) in težke (VH) verige protiteles so pomnožili z RT-PCR iz vseh ustreznih B celic. Izolirane VH in VL so s PCR-jem sestavili v linearna človeška protitelesa. Skupno so na tak način pridobili 15 rekombinantnih monoklonskih protiteles.
Mutageneza in kristalna struktura mAb7968
V drugem sklopu raziskave so izvedli mutagenezo 8 aminokislinskih ostankov, ki sestavljajo epitop CFH, v alanin. Na ta način so določili, kateri aminokislinski ostanki so pomembni za interakcijo protiteles s proteinom CFH. Določili so tudi kristalizirano strukturo protitelesa Fab7968 v kompleksu s CFH pri resoluciji 2 Å. Struktura je pokazala, da se protitelo veže na rahlo drugačno konformacijo CFH. V nativnih pogojih so ostanki 1117 do 1120 urejeni v β ploskev, v kompleksu s protitelesom pa so ti ostanki urejeni v α vijačnico. Prepoznavanje slednje je bistveno za specifičnost protiteles, da vežejo le CFH na površini tumorskih celic. To odkritje tudi nakazuje, da so konformacijsko različni epitopi pomembni za terapevtske tarče.
Od komplementa odvisna citotoksičnost na rakavih celičnih linijah
Izvedli so test od komplementa odvisne citotoksičnosti na različnih rakavih celičnih linijah s petimi monoklonskimi protitelesi. Celice so zmešali s protitelesi in normalnim človeškim serumom, ki je predstavljal vir komplementa. Mešanico so inkubirali pri 37°C in merili citolizo preko sprostitve laktat dehidrogenaze. Ugotovili so, da je protitelo mAb7968 sprožilo celično lizo pri različnih rakavih celičnih linijah. Da bi potrdili aktivacijo komplementa, so analizirali produkte, ki nastanejo pri tovrstni citotoksičnosti (C3a, C5a in C5b-9). Dodatek protitelesa mAb7968 celičnim linijam A549 in H226 v prisotnosti normalnega človeškega seruma je pokazal povečano sprostitev C3a, C5a in nalaganje C5b-9. Poleg takojšne aktivacije komplementa, se C3a in C5a direktno vežeta na dendritične celice ter povzročita aktivacijo in zorenje efektorskih T celic. Ta dolgoročni celični odgovor ima lahko zelo pomemben vpliv na izid bolezni.
In vivo študije rasti tumorjev
Za in vivo študije v miših so razvili mišjo verzijo protitelesa mAb7968. Učinkovitost protiteles so testirali v miših z modelom pljučnega raka in s funkcionalnim imunskim sistemom. Najprej so v miši vbrizgali tumorske celice, nato pa še protitelo mAb7968 ali nepravilno sestavljeno protitelo mAbNctl, ki je služilo kot negativna kontrola. Sledilo je periodično merjenje volumnov tumorjev. Meritve so pokazale, da se volumen tumorjev v dveh skupinah miši, ki so jim vbrizgavali mAb7968, ni bistveno povečal. Pri miših, ki so prejemale negativno kontrolo pa je postopoma rastel.
Zaključek
Avtorji so nakazali nove možnosti za zdravljenje raka z uporabo protiteles proti CFH. Tovrstne oblike terapije bi v pacientih na edinstven način dolgoročno spodbudila imunski odziv in zavirala raka.
