Delovanje na plazmide za zmanjševanje širjenja odpornosti med bakterijami

Uvod

Plazmidi, majhne krožne molekule DNA, ki imajo sposobnost avtonomnega podvojevanja, pogosto nosijo zapis za odpornost proti antibiotikom ali drugim spojinam. Prenašajo se lahko med bakterijami, ki spadajo v isto vrsto ali pa so si filogenetsko v sorodu. Širjenje odpornosti proti antibiotikom in drugim spojinam bi lahko zamejili z delovanjem na plazmide. Bakterije lahko zdravimo od plazmidov (angl. »plasmid curing«) s pomočjo interkalirajočih barvil, povišane inkubacijske temperature in dodajanja nezdružljivih plazmidov.

Zdravljenje z interkalirajočimi spojinami in povišano inkubacijsko temperaturo

Interkalirajoča barvila so spojine, ki se vrinejo med baze v DNA in omogočajo vizualizacijo molekule DNA. Za zdravljenje plazmidov so bila uspešno uporabljena barvila akriflavin, akridin oranžno in etidijev bromid. Bakterije, ki jim želimo odstraniti plazmid, gojimo prekonočno na optimalni temperaturi. Dodamo najvišjo koncentracijo barvila, ki še dopušča njihovo rast. Akridin doseže takojšnjo in popolno inhibicijo podvojevanja plazmidov, vendar so znanstveniki ugotovili, da je takšno delovanje lahko odvisno od vrste bakterije.

Med uspešnimi metodami zdravljenja plazmidov je tudi povišanje inkubacijske temperature za 5-7 °C nad optimalno. Bakterijsko kulturo gojimo pri povišani inkubacijski temperaturi in ko bakterije dosežejo pozno logaritemsko fazo rasti, jih razredčimo in ponovno gojimo pri povišani temperaturi do logaritemske faze. Postopek je potrebno nekajkrat ponoviti, takšno odstranjevanje pa se je izkazalo za uspešno pri zdravljenju na tetraciklin odpornih bakterij Staphylococcus aureus.

Uporaba fenotiazina

Plazmide lahko zdravimo tudi s heterocikličnimi spojinami. Zelo znan primer tega je fenotiazin, ki je aktiven proti mnogim bakterijskim vrstam. Ima tri glavne aktivnosti proti bakteriji: zaviranje delovanja izlivnih črpalk (angl. »efflux pumps«), protimikrobna aktivnost in eliminacija plazmidov. Izlivne črpalke so zadolžene za prenašanje antibiotika v zunajcelični prostor, protimikrobna aktivnost pa prepreči rast bakterij ali pa jih ubije. Zaradi teh aktivnosti so se znanstveniki poglobili v uporabo fenotiazina, sprva z bakterijo E. coli.

Odpornost bakterije na neko spojino lahko merimo z minimalno koncentracijo zaviranja ( angl. »Minimum inhibitory concentration«, MIC), ki nam pove najmanjšo koncentracijo spojine, ki prepreči vidno rast bakterije v µg/ml. Za fenotiazin ima E. coli vrednost MIC nekje od 100 do 150 µg/ml, kar pomeni, da je nanj dokaj odporna. Kljub temu lahko s fenotiazinom dokaj dobro eliminiramo plazmid in prav zato so preučevali mehanizem njegovega delovanja ter delovanje sorodnih spojin. Eliminacija plazmida nam omogoča zdravljenje plazmidne bakterijske odpornosti na antibiotike. V ta namen je bilo kar nekaj poskusov, kot primer bi opisali le enega, nato pa še predstavili širše znanje pridobljeno iz več poskusov. Glavni cilj pa je bila določitev mehanizma delovanja fenotiazina in njemu podobnih spojin.

Delovanje so preizkusili na bakteriji E. coli in vitro. Eliminacijo plazmidov so izvedli v območju koncentracij pod mejo zaviranja rasti bakterij, drugače eliminaciji plazmidov ne bi mogli slediti.

Sprva so bakterije s plazmidom, ki je vseboval operon lac, gojili v gojišču s preučevano spojino podobno fenotiazinu. Nato so jih nanesli na gojišče brez antibiotika, ki pa je vsebovalo barvilo eozin-metilen modro (EMB). EMB je barvilo, ki bakterijsko kolonijo ob prisotnosti operona lac pobarva temno vijolično, v odsotnosti pa rožnato. Po inkubaciji na gojišču z EMB so določili količino izvrženega plazmida tako, da so prešteli kolonije in delili število rožnatih kolonij s celotnim številom kolonij.

Najboljšo eliminacijo plazmida je pokazal 2-kloro-10-(2-dimetilaminoetil)-fenotiazin. Imel je 90% eliminacijo plazmida, prav tako pa se je izkazalo, da je tudi njegova vrednost MIC zelo nizka, to je 3,1 µg/ml.

Ugotovili so, da je za nekatere derivate najbrž težaven prehod čez celično membrano bakterije (spojini trifluoperazin in prometazin). Drugi derivati naj bi se vezali na membrano preko kationske amino skupine, nato pa bi se naj vstavili v notranjost membrane preko hidrofobnega dela (spojini klorpromazin in imipramin). Oboje kaže na to, da je eliminacija plazmida odvisna od porazdelitvenega koeficienta spojine med membrano in vodo. Na prehajanje pa vpliva tudi prepustnost bakterijske membrane, torej so različne vrste bakterij različno odporne.

Prav tako so ugotovili, da substitucija na aromatskem obroču prepreči interakcije med π-elektroni obroča fenotiazina ter tračnih molekul, ki so pomembne za replikacijo plazmidov. Konjugiran π-elektronski sistem preko tricikličnega ogrodja ima simetrično konjugacijo na L-molekularnem mestu.

Sama inhibicija replikacije plazmidov poteka preko vstavljanja spojine v plazmidno DNA ali pa preko zaviranja delovanja DNA-giraze. Vstavljanje poteka preko ene same prekinitve DNA v bližini mesta ori, čemur sledi sprostitev superhelikalne DNA v manj zvito strukturo. Dokaz vstavljene spojine je povišana temperatura tališča DNA. Vstavljanje spojine pa ne poteka le splošno na plazmidni DNA, ampak imajo heterociklični derivati posebno vezavno mesto na DNA z veliko ponovitvami GC. Inhibicija preko zaviranja DNA-giraze pa prepreči nastanek superhelikalnih zavojev. Posledica je bolj sproščena plazmidna DNA ter zavirano podvajanje.

Poleg tega imajo preiskovane spojine tudi vpliv na vezavo plazmidne DNA na membranske proteine. Tvorijo bolj stabilno strukturo in preprečijo prepisovanje.

Preiskave fenotiazinu podobnih struktur so torej omogočile določitev mehanizmov, preko katerih je možno zdraviti plazmidno bakterijsko odpornost na zdravila. Iz tega znanja so izračunali optimalne spojine, ki bi jih lahko uporabili v zdravstvu.

Odstranjevanje plazmida z nezdružljivim plazmidom

Plazmida sta v celici nezdružljiva, če se po podvojitvi med celično delitvijo ne ločita v dve hčerinski celici. Oba hkrati ne moreta obstajati v isti celici, zato se eden izmed njiju izloči. Do izločitve plazmida pride tudi v primeru, ko sta si dva plazmida dovolj podobna. Nezdružljivost je posledica uporabe enakih elementov podvojevanja ali delitve. Primer takšne nezdružljivosti je prisotnost enakih molekul RNA I, ki sodelujejo pri nadzoru podvojevanja plazmida. RNA I so kratke RNA molekule, ki nadzirajo sintezo podvojitvenega proteina RepA. Če mRNA, ki zapisuje RepA, tvori medmolekularni psevdovozel, bo prišlo do translacije zapisa, s čimer bo omogočena podvojitev plazmida. V primeru prisotnosti RNA I pa se medmolekularni psevdovozel ne bo tvoril, zato se RepA ne bo mogel sintetizirati in podvojitev plazmida ne bo mogoča. Med spojine, ki posnemajo delovanje RNA I, sodijo aminoglikozidi in apramicin.

V primeru, da želimo celico zdraviti od plazmida X, moramo vanjo vstaviti plazmid Y, ki je plazmidu X tako podoben, da sta nezdružljiva. Celica bo ob tem najprej izločila plazmid, ki ji ob selekcijskem pritisku ne omogoča preživetja.

Odvisni in nezdružljivi plazmidi

Veliki plazmidi, ki obstajajo v malo kopijah in se prenašajo s konjugacijo, vsebujejo module odvisnosti. Ti so sestavljeni iz dveh komponent, ki morata biti uravnoteženi za uspešno preživetje celice. Primer modula odvisnosti je sistem antitoksin/toksin, ki regulira celično smrt. Sestavljata ga dolgoživa molekula toksina in kratkoživa molekula antitoksina. Ko se ti dve molekuli povežeta, toksin ne sproži celične smrti. Če pa toksin nima protiuteži v obliki antitoksina, bo nastopila celična smrt. Delovanje sistema toksin/antitoksin je lahko nadzorovano preko protismerne RNA, ki se veže na zapis za toksin in prepreči translacijo.

Nov način zdravljenja od plazmidov predstavlja kombinacija nezdružljivosti plazmidov in modulov odvisnosti. Če bakterija vsebuje plazmid X z zapisoma za modul odvisnosti antitoksin/toksin in odpornost proti antibiotiku A, bomo za odstranitev tega plazmida načrtovali plazmid Y. Ta bo imel enako mesto ori kot plazmid X, zaradi česar bosta plazmida nezdružljiva. Na plazmidu Y bosta tudi zapisa za odpornost proti antibiotiku B in antitoksin. Po vstavljanju plazmida Y izvedemo selekcijski pritisk v obliki dodajanja antibiotika B. Bakterija bo za preživetje potrebovala zapis za odpornost proti antibiotiku B, ki se nahaja na plazmidu Y, zato bo ta plazmid obdržala, plazmid X pa izgubila. Po selekciji z antibiotikom B bakterije prenesemo na gojišče, ki antibiotikov ne vsebuje. Pri tem se po nekaj generacijah lahko izgubi tudi plazmid Y. Takšne celice bodo ozdravljene od plazmidov.

Viri

• Kamruzzaman, M., Shoma, S., Thomas, C. M., Partridge, S. R. & Iredell, J. R. Plasmid interference for curing antibiotic resistance plasmids in vivo. PLoS One 12, e0172913 (2017).

• Spengler, G. et al. The mechanism of plasmid curing in bacteria. Curr. Drug Targets 7, 823–41 (2006).

• Trevors, J. Plasmid curing in bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 32, 149–157 (1986).

• Novick, R. P. Plasmid incompatibility. Microbiol. Rev. 51, 381–95 (1987).

• Liu, X. et al. Curing of Plasmid pXO1 from Bacillus anthracis Using Plasmid Incompatibility. PLoS One 7, e29875 (2012).