PowerLeaf – bakterijska solarna baterija

Povzeto po projektu PowerLeaf, ekipe SDU iz Danske iz tekmovanja iGEM 2017.
Avtorica: Barbara Lipovšek

UVOD

Ekipa študentov iz Danske je na tekmovanju iGEM 2017 predstavila svojo idejo PowerLeaf, ki bi lahko bila alternativa sončnim celicam. Gre za bakterijsko solarno baterijo sestavljeno iz dveh delov: enote za shranjevanje energije in enote za pretvarjanje energije. V prvi enoti bi bakterije E. coli fiksirale ogljikov dioksid iz zraka in ga pretvarjale v glukozo, nato pa to do celuloze, v drugi enoti pa bi E. coli to celulozo razgrajevale. Pri tem procesu nastali elektroni bi se nato prenesli do anode preko nanožic. Elektroni nato potujejo proti katodi, to pa ustvarja električni tok. Prva enota bi bila pod kontrolo sistema mirovanja, ki bi omogočil mirovanje celic ponoči. Na ta način bi se zmanjšala izguba energije zaradi metabolizma.

ENOTA ZA SHRANJEVANJE ENERGIJE

Fiksacija ogljika

Ekipa je prvi del enote za shranjevanje energije zasnovala tako, da bi v E. coli vključili gene, ki bi omogočili fiksacijo ogljika. V E. coli so želeli vzpostaviti Calvinov cikel, kjer ta fiksacija poteka. V ciklu sodeluje 11 encimov, od tega je v E. coli potreben vnos samo 3 heterolognih encimov, to so ribuloza-1,5-bifosfat-karboksilaza/oksigenaza (RuBisCo), sedoheptuloza 1,7-bisfosfataza (SBPaza) in fosforibulokinaza A (PRK). Da bi optimizirali proces fiksacije ogljika so želeli v E. coli vnesti še gene iz cso operona bakterije Halothiobacillus neapolitanus, ti so potrebni za tvorbo ɑ-karboksisoma. ɑ-karboksisom je majhen organel, sestavljen iz zunanje proteinske ovojnice in notranjosti. Ovojnico sestavlja 6 proteinov, v notranjosti pa se nahajata encima RuBisCo in ogljik anhidraza. Slednja katalizira pretvorbo HCO^3- do CO₂, tega pa nato RuBisCo uporabi za karboksilacijo ribuloze-1,5-bisfosfata, pri tem nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Calvinov cikel mora poteči trikrat, da se sintetizira gliceraldehid-3-fosfat, ki je izhodna spojina za biosintezo polisaharidov, v tem primeru celuloze.
Dva biološka dela BBa_K1465214 in BBa_K1465228, ki bi omogočila vzpostavitev Calvinovega cikla so želeli združiti v en plazmid, a so zaradi težav pri kloniranju to nalogo opustili. Uspeli pa so združiti dela BBa_K1465204 in BBa_K1465209 v kompozit BBa_K2449030, kjer se nahajajo vsi geni cso operona za tvorbo karboksisoma, ni jim pa uspelo vstaviti Tac promotorja, zato so tudi to nalogo opustili.

Sinteza celuloze

Ekipa se je odločila za shranjevanje energije v obliki celuloze. Za to bi bilo v E. coli potrebno vnesti gene za celuloza sintazo oz. operon acsABCD. Proteina AcsA in AcsB tvorita dimer, prvi je katalitična, drugi pa regulatorna domena. AcsC in AcsD pa sodelujeta pri transportu glukanskih verig iz celice, na zunanjo membrano. AcsA kot osnovni gradnik porablja UDP-glukozo. Ekipa je želela izboljšati biosintezo celoloze v sevu E. coli MG1655, ki že naravno proizvaja majhne količine celuloze kot del biofilma.
Najprej so želeli prenesti celoten operon acsABCD v en vektor pod kontrolo promotorja Tac, ampak so imeli zaradi velikosti plazmida (9000 bp) težave. Odločili so se, da bodo gena za AcsAB dimer vnesli v vektor pSB1C3, gena acsC in acsD pa v vektor pSB1A3, obakrat pod kontrolo Ptac, da bi zagotovili enakovredno izražanje. Tudi to jim je povzročalo težave, zato so to nalogo opustili. Če bi jim kloniranje uspelo, bi biosintezo celuloze testirali z barvilom fluorescent brightener 28, ki se veže na polisaharide. To barvilo po osvetlitvi z UV svetlobo fluorescira modro, torej bi v primeru uspešne biosinteze celuloze videlo modro barvo.

Sistem mirovanja

Sistem mirovanja je hipotetičen sistem, ki bi omogočil mirovanje celic v nočnem času, da bi te takrat porabljale manj energije za svojo rast in metabolizem. Sistem sestavljata 2 komponenti, in sicer fotokontrola ter sistem toksin-antitoksin. Pri fotokontrolni komponenti sodeluje protein PCB (fikocianobilin), ki je občutljiv na svetlobo. Po aktivaciji s svetlobo se signal preko posrednih proteinov prenese do jedra, prepreči se izražanje genov, reguliranih z OmpR. Ponoči se geni pod kontrolo OmpR izražajo. Ta sistem bi sklopili s sistemom toksin-antitoksin, pri čemer je toksin RelE, ta inhibira translacijo. Antitoksin je v tem primeru RelB. Gen relE bi bil pod kontrolo OmpR promotorja, torej bi se ta izražal ponoči, kar naj bi celice poneslo v stanje mirovanja. Za pravilno delovanje tega sistema je zelo pomembno razmerje RelB:RelE. Regulacija mora biti zelo natančna, zato je ekipa z modeliranjem in algoritmi preverjala kako različne ravni izražanja vplivajo na sistem.
Končna zasnova sistema mirovanja je naslednja. Fotokontrolna naprava naj bi bila po kontrolo PenI na plazmidu z velikim številom kopij, gez za antitoksin RelB pod kontrolo pBAD, na plazmidu z majhnim številom kopij. Gen za toksin RelE pa bi bil pod kontrolo OmpR, na plazmidu z majhnim številom kopij ali pa na kromosomu.

ENOTA ZA PRETVARJANJE ENERGIJE

Razgradnja celuloze

Za razgradnjo celuloze sta potrebna 2 encima, in sicer endo-β-1,4-glukanaza (gen cenA) in ekso-β-1,4-glukanaza (gen cex), ki celulozo razgradita do disaharida celobioze. Celuloza se nahaja na ekstracelularni strani, zato je potrebna dostava teh dveh encimov do tja. Za to so uporabili ɑ-hemolizin transportni sistem, in sicer konstruirali so zapise za ta 2 encima s HlyA oznako. Ta omogoči prenos na ekstracelularno stran. Za detekcijo sposobnosti razgradnje celuloze v E. coli so v gojišče dodali karboksimetil celulozo in barvilo Kongo rdeče, ki se veže na celulozo. V primeru uspešne razgradnje celuloze bi morali opaziti razbarvanje, ampak niso opazili nobene razlike med kolonijami z vnesenim plazmidom za razgradnjo celuloze in negativno kontrolo. Izvedli so tudi analizo medija izoliranega iz prekonočne kulture s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE). Ta analiza je pokazala odsotnost endo- in eksoglukanaze.

Nastala celobioza bi nato s pomočjo laktoza permeaze (LacY) prehajala v citosol, tam pa bi potekla razgradnja z encimom celobioza fosforilaza (gen cep94A). Zapis cep94A so vstavili tako v plazmid s srednjim (pSB3K3) kot tudi z visokim številom kopij (pSB1C3), obakrat pod kontoro promotorja LacI. Analiza z NaDS PAGE je pokazala, da je bil ta encim prisoten tako v celičnem lizatu, kot tudi v mediju, ne glede na število kopij plazmida. E. coli z vstavljenim zapisom za Cep94A so testirali zmožnost rasti na celobiozi. Gojili so jih na gojišču z mešanico amikonislin in celobiozo. Koz kontrola so služile E. coli s plazmidom brez zapisa za encim Cep94A. Kultura, ki ni vsebovala zapisa za Cep94A je dosegla po 48 urah vrednost OD₆₀₀=0,2. Po 72 urah je bila vrednost enaka. Kultura s cep94A pa je po 72 urah dosegla vrednost OD₆₀₀=0,9. Ugotovili so tudi, da so E. coli rastle samo če so imele vstavljen plazmid s visokim številom kopij in ne, če so imele vstavljen plazmid s srednjim številom kopij.

Zunajcelični prenos elektronov

Ekipa je napravo zasnovala tako, da bi E. coli rastle na anodi, pri anaerobnem metabolizmu glukoze bi nastajali elektroni, ki bi se preko ti. nanožic prenesli na anodo. Po tem bi se pri prenosu elektronov iz anode proti katodi ustvaril električni tok, ki bi ga lahko uporabljali. Nanožice so dolgi električno prevodni pilusi tipa IV, ki jih tvorijo mikroorganizmi Geobacter sulfurreducens. Ti pilusi so polimeri, sestavljeni iz PilA monomerov, dolgi so lahko tudi do 10 mm. Ta sistem je sicer slabo poznan, zato se je ekipa odločila, da bi bil prenos sistema proteinov, ki tvorijo nanožice, v E. coli prezahteven. Odločili so se, da bodo raje optimizirali oz. povečali električno prevoznost nanožic G. sulfurreducens. Iz literature so razbrali, da je prevodnost nanožic G. metallireducens tudi do 5000-krat večja, ampak ker je delo z G. metallireducens težavno, so se odločili, da bodo delali s G. sulfurreducens. S PCR so sintetizirali fragment sestavljen iz pilA gena iz G. metallireducens, zapisa za rezistenco na kloramfenikol ter regije 500 bp navzgor in navzdol od gena pilA iz G. sulfurreducens. Analiza s pomočjo gelske elektroforeze je pokazala ustrezen fragment dolžine 3000 bp. Fragment so nato želeli vključiti v genom G. sulfurreducens s homologno rekombinacijo. Po elektroporaciji in selekciji na gojišču s kloramfenikolom s koncentracijo 10 µg/ml so analizirali genom zrastlih bakterij. Ugotovili so, da pričakovanega 3000 bp dolgega fragmenta ni bilo prisotnega.

ZAKLJUČEK

Namen tega projekta je razviti alternativno trenutnim virom energije . Ekipa si želi, da bi razvili napravo sestavljeno iz recikliranih materialov, znotraj pa naj bi bile bakterije čimbolj neodvisne. To bi dosegli z genskim inženiringom bakterij tako, da bi te za svojo rast uporabljale onesnažila iz okolja, kar bi poleg trajnostne energije omogočilo tudi čistejše okolje.

VIRI

- http://2017.igem.org/Team:SDU-Denmark#safety
- Du J, Vepachedu V, Cho SH, Kumar M, Nixon BT. Structure of the cellulose synthase complex of Gluconacetobacter hansenii at 23.4 Å resolution. PLoS One. 2016;11(5):1–24.
- Mangan NM, Brenner MP. Systems analysis of the CO2 concentrating mechanism in cyanobacteria. Elife. 2014;3:e02043.
- Mahadevan R, Bond DR, Butler JE, Coppi V, Palsson BO, Schilling CH, et al. Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling Characterization of Metabolism in the Fe ( III ) -Reducing Organism Geobacter sulfurreducens by Constraint-Based Modeling. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1558–68.