Rabdovirusi in drugi RNA(-)-virusi

1 ssRNA NEGATIVNI VIRUSI – SPLOŠEN OPIS

RNA negativni virusi (v nadaljevanju RNA(-)) so virusi, pri katerih ima vlogo genetskega materiala enoverižna molekula RNA negativne polarnosti. Najbolj znani predstavniki te skupine virusov so rabies virus, Marburg virus, Ebola virus, vezikularni stomatitis virus, virus ošpic, virus hepatitisa D... Njihov genom je lahko samostojna molekula RNA (nesegmentirani genom) ali skupek molekul RNA (segmentiran genom). Negativna virusna RNA je komplementarna mRNA, zato se mora najprej prepisati v pozitivno RNA, da lahko poteče translacija. Prepis negativne RNA v komplementarno mRNA opravlja RNA polimeraza.

1.1 RABDOVIRUSI

Rabdovirusi (družina Rhadboviridae) so negativnoverižni RNA virusi z ovojnico in pripadajo redu Mononegavirales, ki vključujejo poleg družine Rhabdoviridae tudi družine Bornaviridae, Filoviridae in Paramyxoviridae. RNA ima na 3'- koncu prosto hidroksilno skupino, na 5'- koncu pa trifosfat. Vsi rabdovirusi imajo 5 strukturnih genov v zaporedju 3'-N-P-M-G-L-5'. Vsaka od teh sekvenc je ločena od sosednjih sekvenc z kratko, močno zvito regijo, ki ima pomembno vlogo pri transkripciji.

1.2 RABDOVIRUSI IN RASTLINE

Poznamo 2 roda rastlinskih rabdovirusov (nukleorabdovirusi in citorabdovirusi). Celico okužijo tako, da tvorijo velike vezikle v jedrih celic. V nekaterih primerih se virusi nalagajo v perinuklearnem prostoru (obdajajo jedro). Virus se mora premikati iz celice v celico preko plazmodezmatalnih kanalov v floemsko celico. Ker plazmodezme navadno preprečujejo premikanje makromolekul, se virusi premikajo k sosednjim celicam preko mehanizmov, ki zvišujejo prepustnostno kapaciteto plazmodezem.

2 STRUKTURA

Za raziskovanje vijačnih živalskih in človeških virusov je bilo veliko zanimanja, saj ti vključujejo pomembne človeške patogene. Virusni genom asociira z nukleoproteinom N, virusno polimerazo L (od RNA odvisna polimeraza RNA) in fosfoproteinom P ter tako tvori RNP (ribonukleoproteinski kompleks). Ta kompleks je obdan s proteinom M. Nukleokapsida je ovita z lipidnim dvoslojem, ki vsebuje glikoprotein G. Glikoprotein G je membranski glikoprotein tipa I. Za oba VSV in RV je bilo dokazano, da G oblikuje trimere na površini lipidnega dvosloja. Dokazano je, da lahko G obstaja v vsaj treh različnih konformacijskih stanjih, ki so odvisne od pH ter so reverzibilne. Polipeptidna veriga G se zvije v štiri različne domene. Glavna antigenska mesta se nahajajo na domenah I in III.

2.1 VIRUSNI PROTEINI

Protein M je glavna strukturna komponenta, ki daje virusu trdnost in stabilizira njegovo zgradbo. Nukleoprotein N ščiti virusno RNA pred degradacijo z encimom RNAzo. Polimeraza L je tesno povezana z nukleoproteinom N in molekulo RNA ter deluje kot RNA-transkriptaza za tvorbo mRNA molekul. [3] Fosfoprotein P deluje kot kofaktor za virusno polimerazo.

3 VSTOP V CELICO

Različne družine teh virusov napadejo različne gostitelje. Virus se mora najprej zliti s plazmalemo. Zlivanje je odvisno od proteinov na virusni ovojnici in od receptorjev na gostiteljski celici. Proteini na virusni ovojnici prepoznajo receptorje na gostitelju, kar sproži endocitozo virusa. Vezikli pripeljejo virione do endosomov, v katerih zapakirani virusi potujejo po citosolu. S pomočjo zlitvenega peptide se membrani endosoma in vezikla zlijeta, tvori se fuzijska pora, virus se sprosti v citosol.

3.1 VIRUS GRIPE

Protein hemagglutinin (HA) prepozna terminalno α-sialično kislino (receptorska molekula). Virusi gripe vstopajo s klatrinsko-posredovano endocitozo ali z vezikli, ki so podobni fagocitom. Ti vezikli pripeljejo virione do endosomov. V endosomu zapakirani virus potuje po citosolu in blizu jedra se razmere v endosomu zakisajo, kar sproži konformacijske spremembe v HA; tako se vstavi zlitveni peptid v membrano gostitelja. Tvori se fuzijska pora, ki omogoča izpust genomskih segmentov virusa gripe.

3.2 RABDOVIRUSI

Adsorpcija rabdovirusov na gostitelja je posredovana z vezavo G proteinov na receptorje na celični površini. Glikoprotein G tvori jamico, ki je pravokotna na virusno ovojnico. Virioni pridejo v endosome s klatrini posredovano endocitozo ali v obliki makropinosomov. Regijo, ki je ključna za olajšano zlitje, imenujemo p2-podoben peptid. Endosomi ob pomoči mikrotubulov transportirajo virione, sledi od pH odvisno zlitje veziklov in tako nastanejo iz zgodnjega endosoma multivezikularni endosomi. Nato se virus zaradi pH ponovno zlije z membrano in odcepi iz endosomalnega vezikla. Sledi »back-fusion« veziklov (zopet zlivanje membran; tokrat se membrana vezikla z virusov zlije z mejo endosomalne membrane). Ko je RNP izpuščen, se genom RNA začne prepisovati z virusno transkriptazo. Na koncu sta transkripcija in replikacija inhibirani, RNP postane intenzivno kondenzirana in transportirana do plazmaleme. Tako se začne odcepljanje, ki zahteva specifične interakcije med ovojnico, ki vsebuje G protein, matriksom in nukleokapsido.

4.1 REPLIKACIJA

Replikacija se začne s prepisovanjem mRNA iz genomske RNA s pomočjo RNA polimeraze. Podvajanje je asimetrično in običajno se proizvede 5- do 10-kratni molski presežek genomske RNA kot antigenomske RNA. Med sintezo leader RNA se zgodi regulativna odločitev, ki narekuje, ali bo RNA polimeraza zaključila transkripcijo leader RNA in začela transkripcijo mRNA ali pa bo začela replikacijo in prezrla vse stop signale in namesto tega sintetiziral celotno antigenomsko RNA (pozitivne polarnosti). Za začetek replikacije je potrebna stalno sinteza proteinov, da se zagotovi vir topnih N proteinov, potrebnih za inkapsidacija nastajajoče RNA. To je pripeljalo do ugotovitve, da je aktivnost RNA polimeraze regulirana z razpoložljivostjo proteina N.

4.2 TRANSKRIPCIJA

Pri transkripciji genoma, RNA polimeraza prepiše 5 subgenomskih mRNA. Genom vsebuje le en promotor, ki se nahaja na 3' koncu. Na poti naleti na start-stop signale na mejnih območjih med (petimi) geni. Stop-start transkripcija omogoči nastanek večje količine mRNA, ki kodira strukturne proteine oz. RNA, ki kodira gene bolj na začetku 3' konca. Gradient poteka v smeri N > P > M > G > L. Prepisana mRNA ima kapico na 5' koncu in je poliadenilirana na 3' koncu in so večinma monocistronske.

4.3 TRANSLACIJA

mRNA se prevaja na prostih ribosomih v citoplazmi gostiteljske celice. mRNA, ki kodira glikoprotein G pa se prevaja na ribosomih na endoplazemskem retikulumu in kasneje sledi glikozilacija (razvejani oligosaharidi). Celični šaperoni sodelujejo pri transportu M proteina na celično membrano in transportu glikoproteina G v Golgijev aparat ter na celično membrano.

5.1 VIRUS OŠPIC

Virus ošpic je velik ssRNA virus, ki spada v družino Paramyxovirus in rod Morbillivirus. Ta vrsta virusa je sestavljena iz lipoproteinske ovojnice in helikalne nukleokapside. Ključni so hemagglutinin (pritrditev virusa na membrano celice), fuzijski protein (prepušča fuzijo virusov s celično površino) ter M-protein (odcepljanje virusnih delcev). Virus vstopi v gostitelja preko respiratornih poti in vpliva na respiratorni epitelij in na imunske celice. Veže se na receptorje SLAM (ki jih izražajo imunske celice), CD46 (ki jih izražajo epitelijske celice) in domnevno tudi na receptorje, ki prenašajo okužbo, če ni receptorjev SLAM in CD46.

5.2 VIRUS EBOLA

Ebola virus je z ovojnico obdan virus. RNP kompleksi virusa Ebole so sestavljeni iz genomske RNA molekule in štirih z virionom združenih strukturnih proteinov NP (nukleoprotein), VP35 (od RNA odvisen RNA polimerazni kofaktor), VP30 (transkripcijski aktivator) in L (od RNA-odvisna RNA polimeraza). Virus ebole vstopi v gostiteljsko celico z makropinocitozo ali s klatrini-posredovano endocitozo. Za vstop v celico so potrebni holesterolni transporter ter virusni glikoproteini. Receptorji na celični površini vežejo virusne delce preko interakcij z virusnim fosfatidilserinom ali virusnimi glikoprotein glikani. Virus vstopi v gostitelja preko zlitja plazmaleme z virusom. Proteaze razgradijo virusne glikoproteine med prenosom skozi endosom, pri čemer izpostavijo za receptor vezavno domeno. Ta domena interagira z NPC1 v poznem endosomu ali lizosomu. Z vezavo glikoproteina se sproži fuzijska zanka, virusna in gostiteljska membrana se zlijeta, sledi sprostitev virusnega nukleoproteina v citoplazmo in začetek virusne replikacije.

5.3 VIRUS STEKLINE

Virus stekline ima cilindrično morfologijo in sodi v rod Lyssavirus iz družine Rhabdoviridae. Virusni genom predstavlja enoverižna RNA negativne polarnosti. Genetska informacija je močno pakirana in zvita z N in M. Geni kodirajo nukleoprotein (N), fosfoprotein (P), matriksni protein (M), glikoprotein (G) in virusno RNA polimerazo (L). Lipidi v ovojnici, izvirajo izključno iz membrane gostiteljske celice. Način replikacije, transkripcije in translacije je enak kot pri večini ssRNA virusov negativne polarnosti. Zaporedje dogodkov v življenjskem ciklusu RABV lahko razdelimo na tri faze. Prva ali zgodnja faza vključuje vezavo virusov na receptorje (npr. acetilholinski receptorji v motorični ploščici, N-CAM in nevtropinski receptor) in vstop v celico. Druga ali srednja faza vključuje transkripcijo in replikacijo, tretja ali pozna faza pa vključuje sestavljanje virusa in sprostitev iz okužene celice. Postopek sestavljanja virusa se začne v srednji fazi življenjskega cikla z inkapsidacijo RNA. Sestava RNP in virionov se nadaljuje v pozno fazo življenjskega cikla, dokler celice ostanejo metabolično aktivne. V zrelih virusih, ki se ločijo od ceične membrane se M nahaja med lipidnim dvoslojem in vijačno zvitim RNP. V zadnji fazi novi RABV pridobijo lipidni dvosloj in se odcepijo od celične membrane.

5.4 VIRUS VEZIKULARNEGA STOMATITISA

Virus vezikularnega stomatitisa (VSV) ima cilindrično morfologijo in sodi v rod Vezikulovirusov iz družine Rhabdoviridae. Genom virusa, tako kot pri vseh rabdovirusih, predstavlja neprekinjena, enoverižna RNA negativne polarnosti. V večjih količinah so prisotni glikoprotein (G), ki je pripet na fosfolipidni dvosloj, matriksni protein (M), ki prekriva notranjo površino dvosloja, in nukleoprotein (N). Način replikacije, transkripcije in translacije je enak kot pri večini ssRNA virusov negativne polarnosti. Okužba z VSV se začne z vezavo virusnega G proteina na receptorje na plazemski membrani in vstopa v celico z receptorsko posredovano endocitozo. Življenjski cikel se nato nadaljuje s transkripcijo in translacijo virusnih mRNA. V zadnji fazi pride do odcepljanja novo nastalih virusov iz celice. Pri tem procesu mora prit do specifičnih interakcij med tremi glavnimi komponentami virusa: lipidnim dvoslojem, ki vsebuje G protein, matriksnim proteinom in RNP. Do brstenja lahko pride le skozi regije plazemske membrane, ki so bogate z G proteinom.

6 GENETSKI INŽENIRING RNA(-) VIRUSOV IN RABDOVIRUSOV

Z metodami imenovanimi reverzni genetski sistemi je mogoče genetsko modificirati rabdoviruse. Slednje so omogočile uporabo virusov v biomedicinske namene kot so izdelava cepiv, genska terapija in onkolitska viroterapija. Način izražanja genov rabdovirusov, visoka genetska stabilnost in nagnjenost k toleranci sprememb v ovojnici virusa so lastnosti, zaradi katerih so rabdovirusi tako zanimivi kot vektorji.

VIRI

• F. Weber, V. Wagner, S. B. Rasmussen, R. Hartmann, S. R. Paludan. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of virology, 2006, 80, 10, 5059-5064.
• B. He, Overview of negative strand RNA viruses. USA: World scientific, 2011.
• K. K. Conzelmann. Nonsegmented negative-strand RNA viruses: genetics and manipulation of viral genomes. Annual review of genetics, 1998, 32, 132-162.
• M. Marsh, A. P. Matthews. Entry of animal viruses into cells. Reviews in medical virology, 1993, 3, 173-185.
• M. Luo. Influenza virus entry. Viral molecular machines, 2011, 726, 201-221.
• Amidiouni, H., Rhaffouli, H. E. Ebola virus and other Filoviruses: an overview. Journal of coastal life medicine, 2015, 9, 18-26
• P. Ascenzi, A. Bocedi, J. Heptonstall, M. R. Capobianchi, A. Di Caro, E. M. Martino Bolognesi, G. Ippolito. Ebolavirus and Marburgvirus: insight the Filoviridae family. Molecular aspects of medicine, 2008, 29, 151-185.
• S. M. Tank, W. Maury. Ebola virus entry: a curious and complex series of events. Plos pathogens, 2015, 11,4.
• S. Delpeut, R. S. Noyce, R. Siu, C. D. Richardson. Host factors and measles virus replication. Science direct, 2012, 2, 767-777.
• H. Y. Naim. Measles virus. Human vaccines & immunotherapeutics, 2015, 11, 1, 21-26.
• J. R. Stalkup, A review of measles virus. Dermatologic clinics, 2002, 20, 2, 209-215.
• O. Jackson, R. G. Dietzgen, M. M. Goodin, J. N. Bragg and M. Deng. Biology of plant rhabdoviruses. Annual reviews, 2005, 43, 623-660.
• K.K. Conzelmann. Nonsegmented negative-strand RNA viruses – genetics and manipulation of viral genomes. Annual reviews genetics, 1998, 32, 123-162.
• Regan, A. D. And Whittaker, G., R. Entry of rhabdoviruses into animal cells. Advances in experimental medicine and biology, 2013, 790, 166-177.
• U. B. R. Balasuriya et al. Fenner's veterinary virology (fifth edition). USA: Academic press, 2017.
• Kuzmin, L., V., Novella, L., S., Dietzgen, R., G., Padhi, A. And Kupprecht, C., E. The rhabdoviruses: biodiversity, phylogenetics and evolution. Infect genetics evolution, 2009, 4, 541-553.
• Albertini and Y. Gaudin. Negative strand RNA virus. USA: World scientific publishing, 2011.
• W. H. Wunner, K. K. Conzelmann. Rabies virus. USA: Academic press, 2013.
• Z. F. Fu. The world of rhabdoviruses. USA: Springer science & business media, 2006.
• Strauss, E., Strauss, J., Robinson, W., Palmer, E., Marion, P. and Estes, M. Replication strategies of the single stranded RNA viruses of Eukaryotes. Heidelberg: Springer-Verlag, 1983.

• Ludwig, A. and Hengel, H. (2009). Vesicular Stomatitis Virus Infection.

• Maclachlan, N., Dubovi, E. and Fenner, F. (2017). Fenner's veterinary virology. London: Elsevier.

• U. B. R. Balasuriya et al. Fenner's veterinary virology (fifth edition). USA: Academic press, 2017.
• R. G. Dietzgen, I. V. Kuzmin. Rhabdoviruses: Molecular Taxonomy, Evolution, Genomics, Ecology, Host-Vector Interactions, Cytopathology and Control Norfolk: Caister Academic Press, 2012.
• J. C. Brown, W. W. Newcomb, G. W. Wertz. Helical virus structure: tje case of the rhabdovirus bullet. Viruses, 2010, 2, 4, 995-1001.
• Albertini, Y. Gaudin. Negative strand RNA virus. USA: World scientific, 2011.
• U. B. R. Balasuriya et al. Fenner's veterinary virology (fifth edition). USA: Academic press, 2017. (slika stran 31)
• S. P. Whelan, J. N. Barr, Wertz G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current topics in microbiology and immunology, 2004, 283, 61-119.
• M. Lafon. Rabies virus receptors. Journal of neurovirology, 2005, 11, 82-87.