MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov

Izvorni članek: Weber E, Engler C, Gruetzner R, Werner S, Marillonnet S (2011) A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs. PLoS ONE 6(2): e16765. [1]

UVOD

Modularni klonirani sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov MoClo temelji na metodi sestavljanja fragmentov DNA Golden Gate, ki omogoča one-pot sestavljanje več fragmentov DNA v želenem vrstnem redu in z visoko učinkovitostjo. MoClo je hierarhična nadgradnja te metode, ki omogoča sestavitev večgenskih konstruktov iz osnovnih modulov (osnovnih bioloških zaporedij) v treh stopnjah, izvedenih po metodi Golden Gate. To je mogoče, ker na koncih posameznih fragmentov ležijo primerno orientirana prepoznavna zaporedja za restriktazo tipa IIs, ki cepi izven prepoznavnih zaporedij. Na primerni oddaljenosti – točno tam, kjer poteče restrikcija, pa leži značilno zaporedje štirih nukleotidov. Po restrikciji le-ti postanejo lepljivi konci, ki so komplementarni med dvema moduloma. Sistem poznamo od leta 2011, ko so njegovi avtorji objavili, da jim je v treh korakih uspelo sestaviti večgenski konstrukt, dolg 33 kb, z enajstimi transkripcijskimi enotami, sestavljenimi iz 44 ločenih osnovnih modulov.

STAREJŠI STANDARDIZIRANI SISTEMI SESTAVLJANJA S POMOČJO RESTRIKCIJSKIH ENCIMOV

Prve standardizirane konstrukte DNA so s pomočjo restriktaz namesto s homologno rekombinacijo pripravili po metodi NOMAD. Knjižnice modulov s konci s prepoznavnim zaporedjem za restriktazo StyI so omogočale ligacijo v dizajniran vektor že leta 1996, vendar je bil postopek dolgotrajen: vsak konstrukt je bilo potrebno klonirati posebej. Leta 2003 je v uporabo stopil sistem BioBrick, ki je omogočil sestavljanje osnovnih bioloških delov. Konci le-teh so idempotentni – po sestavitvi dveh delov absolutni konci ohranijo prepoznavna mesta za restriktaze (in restrikcijska mesta). Pri tem sistemu isti postopek ponavljamo in s tem dobimo vse večje konstrukte. Kasneje so uvedli razširitve sistema v smislu večjega števila standardov, ki omogočajo primernejše spoje med izbranimi deli, tehnično to pomeni povečanje nabora restriktaz. Kljub temu pa tej metodi ni uspelo doseči združevanja več fragmentov DNA v enem samem koraku, prav tako je za pomnoževanje posameznih konstruktov potrebno načrtati/uporabiti zmeraj nove, unikatne začetne oligonukleotide. Od leta 2009 poznamo še eno metodo kloniranja, imenovano Golden Gate, pri kateri lahko z eno samo reakcijo zelo učinkovito sestavimo konstrukt iz tedaj devetih fragmentov DNA, pri čemer dosežemo tudi želeno končno zaporedje. Metoda temelji na delovanju restriktaz IIs, ki režejo izven prepoznavnih zaporedij (tako tudi pri NOMAD, medtem ko restriktaze pri BioBrick režejo prav tam). Če prepoznavna zaporedja zanje uvedemo na oba konca izbranega zaporedja v ustrezni orientaciji, lahko po restrikciji pridobimo fragment brez prepoznavnih zaporedij, izpostavi pa se spojitveno zaporedje (lepljivi konci).

MoClo je nadgradnja kloniranja po metodi Golden Gate, ki omogoča hierarhično sestavljanje osnovnih modulov (promotorjev, 5’-neprevedenih regij, signalnih peptidov, kodirajočih zaporedij in terminatorjev) do večgenskih konstruktov. Ta sistem kloniranja, ki so ga predstavili leta 2011, omogoča sestavljanje od osnovnih delov do večgenskih konstruktov v treh korakih, pri čemer lahko v vsakem koraku združimo večje število delov v predvideno zaporedje. Ob tem avtorji trdijo, da je sistem izjemno učinkovit. Ta sistem kloniranja omogoča relativno enostavno izmenjavo fragmentov oz. modulov istega tipa, s čimer lahko pridobimo veliko število kombinacij (več)genskih konstruktov. Takšen pristop nam olajša optimizacijo želenega fenotipa. Uporaben je za nalaganje genov in metabolični inženiring: od sinteze novih antibiotikov, biogoriv in drugih metabolitov do inženiringa minimalne prostoživeče celice.

MoClo SISTEM

Na začetku je smiselno pojasniti pomen nekaterih izrazov, uporabljenih v nadaljevanju. Modul je standardiziran fragment DNA in je že pripravljen za nadaljnje kloniranje po sistemu MoClo. Sistem je hierarhičen; tako poznamo module ničte, prve in druge ravni, ki jih vključujemo v standardizirane destinacijske vektorje ničte, prve in druge ravni. Osnovni moduli so petih tipov glede na njihov biološki pomen: promotorji, 5'-neprevedena zaporedja, signalni peptidi, kodirajoča zaporedja in terminatorji. Shranjeni so v standardiziranem vektorju ničte ravni. Moduli prve ravni so samostojne transkripcijske enote, moduli druge ravni pa večgenski konstrukti. Vsak tip modula iste ravni ima na obeh koncih prepoznavno zaporedje za restriktazo IIs (BpiI ali BsaI) in značilno zaporedje štirih nukleotidov (značilna škatla), ki omogočajo sestavljanje osnovnih tipov v zmeraj enakem (navedenem) zaporedju, saj sta po dva konca med seboj komplementarna. Prepoznavnih zaporedij za restriktazo med moduli se po ligaciji v destinacijski vektor znebimo, kar onemogoči restrikcijo v nadaljnjih stopnjah kloniranja.

Ničta raven

Najosnovnejši gradniki oz. moduli ničte ravni so petih tipov: promotorji (P), 5’-neprevedene regije (U), signalni peptidi (S), kodirajoča zaporedja (C) in terminatorji (T). Vključimo jih v destinacijske vektorje pripadajočega tipa, torej: pL0-P, pL0-U, pL0-S, pL0-C in pL0-T. V primeru, da kodirajoče zaporedje zapisuje za citosolni protein in zato nima signalnega peptida, ga vključimo v destinacijski vektor pL0-SC. Analogno velja za fuzije promotorjev in 5'-neprevedenih regij, ki jih vključimo v destinacijski vektor pL0-PU. Vsako zaporedje (v nadaljevanju: izbrano zaporedje), ki ga želimo dodati v knjižnico osnovnih modulov, moramo najprej pomnožiti, pri čemer načrtamo začetne oligonukleotide z ustreznimi previsnimi konci: na 5'-konec oligonukleotida dodamo prepoznavno zaporedje za restriktazo BpiI, 2 nukleotida po izbiri, nato pa značilno zaporedje štirih nukleotidov, ki je standardizirano za posamezen tip osnovnega modula. Previsni konec torej izgleda tako: 5'-tgaagacnn1234. V isti reakciji se znebimo tudi prepoznavnih zaporedij za restriktaze IIs (BpiI in BsaI), in sicer tako, da načrtamo začetne oligonukleotide s previsnimi konci: 5'-prepoznavno zaporedje za BpiI-nn-prepoznavno zaporedje za BpiI ali BsaI s tiho točkovno mutacijo-zaporedje, ki ga želimo pomnožiti. Pri tem moramo paziti, da sta uvedeni točkovni mutaciji komplementarni med smernim in protismernim začetnim oligonukleotidom in unikatni v primeru več takšnih mest v istem izbranem zaporedju.

Sledi prvi korak kloniranja, v katerem sestavimo pomnožena zaporedja v enega od osnovnih tipov (npr. pri fuziji kodirajočih zaporedij ali v primeru, ko smo morali pri PCR tudi točkovno mutirati del izbranega zaporedja, pri čemer smo dobili fragmentirano izbrano zaporedje s komplementarnimi konci). V istem koraku t. i. module ničte ravni vključimo v standardiziran destinacijski vektor ničte ravni. V reakciji nastopajo: produkt PCR, destinacijski vektor, restriktaza BpiI in T4 DNA ligaza. Destinacijski vektor ničte ravni ima ogrodje enako kot pUC19, zapis za odpornost na spektinomicin in zapis za podenoto betagalaktozidaze, LacZα. Na obeh koncih zapisa za LacZα od znotraj navzven ležijo: prepoznavno zaporedje za BpiI, značilno škatlo in prepoznavno zaporedje za BsaI. Pri restrikciji s sledečo ligacijo pride do izmenjave zapisa za LacZα s produktom PCR, zato lahko po transformaciji E. coli DH5α ali DH10β in gojenju na selekcijskem gojišču spektinomicinom in X-Gal lažje najdemo celice z želenim konstruktom (belo-modri test; pozitivne kolonije so bele barve). Ničta raven omogoča sestavljanje modulov istega tipa, pri čemer moramo za urejen vrstni red poskrbeti sami z izborom prekrivajočih se lepljivih koncev. S to ravnjo pridobimo osnovni modul določenega tipa, s tem pa tudi značilna prepoznavna in spojitvena zaporedja na obeh koncih vključka. Ker so vsi v istem vektorju, je potrditev nukleotidnega zaporedja olajšana, saj lahko za vsa zaporedja istega tipa pri sekvenciranju, pa tudi pri PCR na osnovi kolonije, uporabimo enak par začetnih nukleotidov. Takšen je torej postopek za dodajanje novega izbranega zaporedja v knjižnico modulov ničte ravni.

Prva raven

Prva raven kloniranja omogoča sestavljanje različnih tipov modulov ničte ravni v evkariontske transkripcijske enote (TU). V splošnem so sestavljene iz promotorja, 5'-neprevedene regije, signalnega peptida, kodirajočega zaporedja in terminatorja v tem zaporedju. Transkripcijske enote prve ravni vključimo v destinacijski vektor prve ravni z zapisom za rezistenco na ampicilin in ponovno na mesto zapisa za LacZα, ki ga od znotraj navzven obdajajo: prepoznavno zaporedje za BsaI, dve različni značilni škatli (prva pripada modulom ničte ravni, druga modulom prve ravni) in prepoznavno zaporedje za BpiI. Na voljo imamo sedem destinacijskih vektorjev prve ravni, ki se razlikujejo v omenjeni drugi značilni škatli, imenujemo jih pL1F-x; x je število od 1 do 7. Tudi te, druge značilne škatle, so kompatibilne med dvema moduloma prve ravni. V reakciji nastopajo vsi tipi modulov ničte ravni (vstavljeni v vektorje ničte ravni), destinacijski vektor prve ravni, restriktaza BsaI in T4 DNA ligaza. Po reakciji dobimo modul prve ravni – samostojno transkripcijsko enoto. Ker lahko v naslednjem koraku transkripcijske enote vstavljamo tudi v obratni orientaciji, so avtorji pripravili še analogne destinacijske vektorje prve ravni z obratno orientacijo drugega značilnega zaporedja štirih nukleotidov, imenovane pL1R-x.

Druga raven

Druga raven kloniranja je namenjena pridobitvi večgenskih konstruktov, torej sestavljanju transkripcijskih enot. Vsak od sedmih destinacijskih vektorjev druge ravni (pL2-x; x je število od 1 do 7) je zasnovan tako, da ima zapis za rezistenco na kanamicin, pri reakciji pa poteče izmenjava operona za biosintezo kantaksantina (CRed), ki kolonije obarva rdeče (po kloniranju so pozitivne kolonije bele). Operon CRed je obdan s prepoznavnimi mesti za restriktazo BpiI, na 5'-koncu mu od znotraj navzven sledi druga značilna škatla, komplementarna modulom prve ravni (x v pL2-x predstavlja številko modula prve ravni, ki ga kloniramo na 5'-konec v destinacijski vektor druge ravni). Na 3'-koncu operona CRed prepoznavnemu mestu za BpiI sledi značilna škatla, ki je enaka pri vseh pL2-x. Da dosežemo ligacijo 3'-vstavljene TU, v reakcijo dodamo vektor, ki nosi zapis za končno povezovalno zaporedje (ang. end-linker), pELE-x; x je število od 1 do 7 in predstavlja zaporedno številko modula prve ravni, ki ga kloniramo na 3'-konec v destinacijski vektor druge ravni. Na obeh straneh zapisa za končno povezovalno zaporedje ima od znotraj navzven značilna škatla in prepoznavno mesto za BpiI. V reakciji lahko nastopa največ šest modulov prve ravni (ker je 5'-značilno zaporedje pL1F-1 komplementarno 3'-značilnemu zaporedju pL1F-7), vektor s končnim povezovalnim zaporedjem, destinacijski vektor druge ravni, restriktaza BpiI in T4 DNA ligaza. To je zmeraj končna stopnja kloniranja po sistemu MoClo.

x

Višje ravni

Če želimo v destinacijski vektor druge ravni vnesti več kot šest TU, se lahko poslužimo dodatnih dveh naborov vektorjev s končnim linkerjem, in sicer pELB-x in pELR-x, kjer x predstavlja število od 1 do 7. Ta dva vektorja nosita zapis za LacZα oz. CRed, ki ga od znotraj navzven obdajajo: prepoznavno zaporedje za BsaI oz. Esp3I, značilno zaporedje štirih nukleotidov in prepoznavno zaporedje za BpiI. V praksi ta dva seta vektorjev uporabimo namesto pELE-x in s tem uvedemo dve novi prepoznavni zaporedji za restriktazo BsaI oz. Esp3I. Uspešnost kloniranja fenotipsko ugotovimo z rdeče-modrim testom.

Negativne ravni

Poslužujemo se lahko tudi t. i. negativnih ravni, pri katerih posamezen osnovni modul razdelimo na manjše fragmente, ki še vedno omogočajo enak princip kloniranja. Pri tem pridobimo možnost enostavne zamenjave teh fragmentov. Primer uporabe so odprti bralni okvirji, ki kodirajo za fuzijo več proteinov, posameznih proteinskih domen ali za proteine s C-končnim signalnim peptidom.