Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov
Izvorni članek: Pfleger, B. F., Pitera, D. J., Smolke, C. D., Keasling, J.D. Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes. Nat. biotechnol. 24, 1027-1032 (2006). [1]
Uvod
V izbranem članku so istočasno nastavljali izražanje več genov znotraj operonov tako, da so generirali in pregledali velike knjižnice TIGR, ki vsebujejo kontrolne elemente, ki vključujejo sekundarne strukture mRNA, RNazna cepitvena mesta in zaporedja z »zaplenjenimi« RBS. Uporabili so operonski reporterski sistem, ki vsebuje gena, ki kodirata za rdeči fluorescenčni protein DsRed (rfpEC) in zeleni fluorescenčni protein GFP (gfpUV). Na ta način so lahko merili relativno gensko ekspresijo, ki izhaja iz knjižnic TIGR.
Nastanek knjižnice TIGR zaporedij
Veliko knjižnico TIGR zaporedij (>10^4) so sestavili s kombiniranjem štirih nizov oligonukleotidov z uporabo PCR. Vsak oligonukleotid je vseboval dve 15-nt zaporedji, ki sta bili komplementarni zaporedju v sosednjem oligonukleotidu, tako da je bila po več krogih PCR ustvarjena serija himernih molekul DNA, ki so vsebovale oligonukleotide iz vsakega od štirih nizov. Med hibridizacijskimi zaporedji na obeh koncih vsakega oligonukleotida je bilo variabilno zaporedje z raznolikimi značilnostmi. Za kloniranje knjižnice TIGR med reporterska gena so uporabili specifična restrikcijska mesta, ki so jih vključili v pomnoževalne primerje.
Oligonukleotidi, ki so jih uporabili za nastanek TIGR, so bili načrtovani tako, da TIGR vsebuje tri regije, dve variabilni lasnični zaporedji (5' lasnica je sestavljena iz oligonukleotidov 1 in 2, 3' lasnica iz 3 in 4), ki obkrožata eno-verižno regijo (iz oligonukleotidov 2 in 3), ki vključuje različna mesta za RNazo E. TIGR zaporedja, ki vsebujejo endonukleazno mesto, se po transkripciji razcepijo na dva sekundarna transkripta, katerih stabilnost je odvisna od sekundarnih struktur, ki obkrožajo RNazno mesto. Vsak izmed 4 uporabljenih setov je vseboval 9 do 11 oligonukleotidov, iz katerih so tako generirali več kot 10^4 možnih TIGR. Čeprav je vključevanje degeneracij pri nekaterih oligonukleotidih in uporaba PCR pogojev z napako povečala število možnih kombinacij zaporedij, je bila dejanska velikost knjižnice določena s številom klonov, dobljenih po elektroporaciji.
Fluorescenca transformiranih celic
Celice, ki so nosile reporterske knjižnice, so pokazale širok spekter fluorescenčnih fenotipov. Celice, ki so močno fluorescirale, so izolirali s fluorescenčno citometrijo, da bi dodatno okarakterizirali knjižnico. Kulture razvrščenih celic so gojili v plošči s 96 vdolbinami, da so določili fluorescenco vsakega konstrukta po 24 urah. Relativno razmerje fluorescenc, rdeče- zeleno, se je razlikovalo za dva reda velikosti (od 45:1 DsRed/GFP do 3:1 GFP/DsRed), odvisno od intergenske regije. Kot so pričakovali, so se porazdelitve relativnih nivojev mRNA (te so določili z PCR v realnem času in dot blot hibridizacijo) in razmerij fluorescenc razlikovale, kar kaže, da lahko TIGR vplivajo tudi na translacijo. TIGR zaporedja so na splošno imela močnejši vpliv na ekspresijo gena na 3' od TIGR kot na gen na 5' od TIGR.
Učinki TIGR na izražanje genov
Da bi okarakterizirali mehanizme, ki so odgovorni za dobljena razmerja izražanja, so sekvencirali operone iz petnajstih plazmidov. Za veliko zaporedij so predvidevali, da tvorijo sekundarne strukture z variabilno velikostjo lasnic in enoverižnih regij. Sekundarne strukture in velikostna porazdelitev transkriptov (ocenjena iz analize northern blota) kažejo, da so za opažene razlike v izražanju genov v knjižnici odgovorni vsaj trije mehanizmi, ki so podrobneje opisani v nadaljevanju.
Diferencialno procesiranje mRNA
V zvezi z intergensko cepitvijo in diferencialnim procesiranjem sekundarnih mRNA so pokazali, da je vključitev RNaznih mest med dve kodirajoči regiji transkripta ločila stabilnost teh kodirajočih regij in s tem proizvodnjo ustreznih proteinov. Večina vzorcev v knjižnici TIGR je imela dva različna transkripta z dolžinami približno 1.800 in 800 baz, ki ustrezata predvidenim primarnim (gfpUV in rfpEC kodirajoči regiji na enem transkriptu) in sekundarnim transkriptom (gfpUV ali rfpEC kodirajoča regija). To kaže na cepitev, zaradi katere nastaneta dva neodvisna sekundarna transkripta, katerih stabilnost in na koncu količina proizvedenega proteina sta odvisni od preostalega TIGR zaporedja na 3'- in 5'-koncih ločenih transkriptov. Razlike v intenzivnosti lis primarnih in sekundarnih transkriptov po northern blotu kažejo na različno stabilnost transkriptov.
Terminacija transkripcije
Kar zadeva terminacijo transkripcije, bi lahko ustvarili velika razmerja v ekspresiji prvega gena glede na drug gen s povečanjem frekvence terminacije pred transkripcijo 3' gena. V knjižnici TIGR je bila celotna porazdelitev razmerij fluorescence zamaknjena pri skoraj 70 % klonov, ki kažejo več rdeče fluorescence (prvi gen) kot zelene fluorescence (drugi gen). Najverjetnejša razlaga za popačenost razmerja v prid prvega gena je prezgodnja prekinitev transkripcije zaradi velikih intergenskih sekundarnih struktur med kodirajočimi območji, to so pojasnili s konkretnim primerom. Predvideva se, da vzorec 1 TIGR vsebuje dve zelo veliki lasnici z več kot 20 bp v vsakem steblu. Northern blot analize so pokazale veliko količino stabilnega rfpEC transkripta, ki ustreza velikosti posameznega gena, in zelo malo gfpUV transkripta, bodisi polne dolžine bodisi transkripta, ki vsebuje samo gfpUV. Močne lasnice v tem TIGR lahko spodbudijo prezgodnjo prekinitev transkripcije in/ali zaščitijo pred eksoribonukleazami. Oba mehanizma povečata razmerje številčnosti prvega genskega produkta glede na drugi genski produkt (rdeče/zeleno).
Preprečitev vezave RBS
Končno je zaplenitev RBS povzročila številne vzorce, ki kažejo bistveno razliko med relativnimi nivoji mRNA in proteinov (sl. 2c, d in dopolnilna slika 1). V mnogih od teh vzorcev je bil gfpUV RBS del sekundarne strukture, tako da je cis-bazno združevanje RBS lahko preprečilo, da bi se ribosom naložil na transkript. Sekundarne strukture, ki vključujejo RBS, zmanjšujejo stopnjo začetka translacije. Vzorec 3, ki najbolje ponazarja ta mehanizem, je sestavljen iz štirih lasnic, od katerih zadnja vključuje RBS na dnu njenega stebla. Kljub veliki količini gfpUV mRNA (polne dolžine in sekundarnih transkriptov, ki vsebujejo samo gfpUV) je bilo zelo malo zelene fluorescence, kar kaže, da se ribosom ni mogel naložiti na 5' RBS druge kodirajoče regije.
