Sistem Rex pri bakteriji Escherichia coli

UVOD

Bakterije se pred okužbo z bakteriofagi lahko branijo na več načinov, med drugimi tudi s sistemi abortivne infekcije (Abi). Ti sistemi vodijo okuženo celico v smrt in tako preprečijo razmnoževanje fagov ter njihovo širitev v ostale celice. Tarče sistemov Abi so običajno ključni koraki razmnoževanja fagov: replikacija, transkripcija in translacija. Sisteme Abi se raziskuje že več kot 50 let, vendar jih še vedno ne razumemo dobro. Razlog se delno skriva v njihovi kompleksnosti, delno pa v samem pomanjkanju znanja o biologiji fagov.

SISTEM REX

Najbolj značilen sistem Abi je sistem Rex v bakteriji Escherichia coli. Odkrili so ga na bakteriofagu λ, ki se v celici nahaja v lizogenem ciklu. rexA in rexB sta ena izmed redkih genov, ki se izrazita iz profaga λ. V lizogenem ciklu niso odkrili nobene njune vloge. Ko pa pride do superinfekcije celice z nekim drugim bakteriofagom, pa igrata ključno vlogo pri obrambi. Ta obrambna vloga je bila najbolje raziskana na primeru faga T4. Ko je fag T4 normalen (wild type), je sposoben litično okužiti E. coli z lizogenim profagom λ, saj kodira dva proteina (RIIA in RIIB), ki se mu pomagata izogniti sistemu Rex. V primeru da ima T4 mutacijo na lokusu rII, kar pomeni, da ima mutirana rIIA in/ali rIIB, do lize ne pride, saj pride do aktivacije sistema Rex, kar sproži samomor celice in posledično izključitev faga T4rII. Ta se tako ne more razmnožiti in okužiti še sosednjih celic.

REXA

Okužba lizogenov λ s T4rII poteka normalno vse do začetka replikacije T4 DNA. Kot replikacijski oz. rekombinacijski intermediat nastane kompleks protein-DNA, kar povzroči aktivacijo proteina RexA, ki je produkt gena rexA. RexA je 31 kDA velik polipeptid, sestavljen iz 279 aminokislinskih ostankov. Vsebuje veliko hidrofilnih aminokislin, kar kaže na to, da gre za citoplazemski protein. Deluje kot znotrajcelični senzor, ki aktivira membranski protein RexB. Ta povzroči padec membranskega potenciala. Raziskave so pokazale, da sta za njegovo aktivacijo potrebna vsaj dva RexA proteina, kar kaže na to, da je za aktivnost sistema Rex pomembno razmerje koncentracij omenjenih proteinov. Raziskave so pokazale, da mutanti T4, ki imajo pomanjkljivo replikacijo ali rekombinacijo, ne kažejo izgube membranskega potenciala.

REXB

Gen rexB kodira 16 kDa velik protein RexB, ki je sestavljen predvsem iz hidrofobnih aminokislinskih ostankov. Hidropatski profil proteina RexB vsebuje štiri hidrofobne vrhove, ki so značilni za membranske segmente transmembranskih proteinov. Nabite aminokisline so skoraj izključno omejene na hidrofilne regije. Na podlagi teh opažanj, skupaj s von Heije-vim pravilom “pozitivno znotraj” za porazdelitev nabitih aminokislin med hidrofilne regije transmembranskih proteinov, so predlagali topološki model proteina. RexB je notranji membranski protein s štirimi transmembranskimi domenami; amino in karboksilni konci, kot tudi osrednji hidrofilni segment, so citoplazemski, druga in četrta hidrofilna zaporedja pa sta periplazemska. RexB je po funkciji ionski kanalček, kar dokazujejo poročila, da je izključitev Rex odvisna od ionske sestave zunanjega medija. Izključitev Rex je občutljiva na zunajcelični pH in na koncentracijo monovalentnih kationov. Če je koncentracija monovalentnih kationov nizka (<1 mM), pride do izključitve pri pH 6, vendar ne pri nevtralnem pH. Topologija proteina RexB lahko razloži to odvisnost od zunajceličnega pH. Prva periplazemska domena vsebuje dva histidinska ostanka (ostanka 27 in 38), katerih ionizacija naj bi bila močno prizadeta v tem območju pH, kar pomembno vpliva na konformacijo RexB. Izključitev T4rII zahteva prisotnost monovalentnih kationov, kot so H+, Na+, K+, NH4+ ali Cs+ v kulturi in je oslabljena ob prisotnosti dvovalentnih kationov, kot so Mg2+ ali Ca2+, poliaminov, saharoze, arginina, lizina, spermidina in več diaminov. Te ugotovitve so skladne z vlogo RexB kot ionskega kanalčka, hkrati pa kažejo, da je ionska izmenjava preko RexB nespecifična in ne razlikuje ionov niti po naboju niti po velikosti. Ker se zdi, da je ionska izmenjava regulirana samo s koncentracijo, je možno, da RexB deluje tako, da tvori lezijo v membrani gostitelja, kar moti ionski diferencial preko citoplazemske membrane. Okužba lizogena, ki vsebuje genski zapis za proteine Rex, s T4rII povzroči zmanjšanje membranskega potenciala, protonske gibalne sile in hiter padec nivoja ATP. S tem se zmanjša sinteza makromolekul in prekine celično razmnoževanje. Med tem se prekine tudi okužba s fagom, saj ta potrebuje ATP ali od ATP odvisne celične komponente. Ko so lizogeni λ okuženi s T4rII mutanti, se okužba nadaljuje normalno, dokler se ne začne replikacija T4 DNA. Nato pride do padca membranskega potenciala, ki ga spremlja znižanje ravni celičnega ATP. Ta padec celične energije je največji, če so v mediju prisotni monovalentni kationi in če je pH nižji od 7. Padec ravni ATP je lahko posledica spremembe membranske ATPaze, ki jo povzroči zmanjšanje membranskega potenciala in ne blokiranje sinteze ATP, saj padca ravni ATP niso opazili v celicah, ki nimajo membranske ATPaze zaradi mutacije unc. Dodatek Mg2+ ali poliaminov v zunanji medij pred deseto minuto okužbe lahko prepreči izključitev T4rll. Izključitev se po šesti minuti obrne z omejenim uspehom. To je verjetno posledica zmanjšanega vnosa magnezija ali poliaminov v tem času, ki ga lahko pripišemo zmanjšani celični energiji. Zmanjšanje membranskega potenciala je odvisno od razmerja med RexA in RexB. Izguba membranskega potenciala se lahko sproži pri povečanju razmerja med RexA in RexB, tudi v neokuženih celicah. Prekomerno izražanje RexB glede na RexA pa povzroči zmanjšanje izključitve Rex. Zaradi teh ugotovitev so prišli do modela izključitve Rex, ki deluje kot altruistični modul celične smrti, ki se aktivira ob okužbi z Rex občutljivim fagom. Po tem modelu RexB deluje kot "regulatorna" enota za tvorbo por v notranji membrani gostiteljske celice, vendar je neaktivna, kadar je izražena v enakih koncentracijah s senzorsko enoto RexA. Okužba gostitelja s T4rll povzroči povečanje razmerja med RexA in RexB in vodi do aktivacije por RexB preko neposredne interakcije z vsaj dvema proteinoma RexA. Če je RexB čezmerno izražen, potem se zmanjša verjetnost interakcije z več podenotami RexA, kar povzroči zmanjšanje izključitve.

PREPREČEVANJE SAMOIZKLJUČITVE

Izključitev Rex je odvisna od stopnje izražanja rex genov. Medtem ko v normalnih pogojih lizogeni λ izločajo le T4rII mutante, navadnih T4 pa ne, so z induciranim prekomernim izražanjem genov rex dosegli, da so lizogeni λ izločali tudi normalne T4. Poleg normalnih T4 so izločali tudi vse ostale testirane fage razen faga λ. To je raziskovalce privedlo do sklepa, da ima fag λ nek način s katerim prepreči izključitev samega sebe v primeru, da le-ta vstopi v litični cikel. Znano je bilo, da je za aktivacijo enega proteina RexB potrebnih več proteinov RexA, kar so so ugotovili z uvedbo prekomernega izražanja rexA ob prisotnosti RexB v nelizogenih celicah. Postavili so hipotezo, da bi lahko za preprečitev samoizključitve fag λ izkoristil prekomerno izražanje rexB. To bi povzročilo njihovo neaktivnost zaradi manjšega razmerja RexA/RexB v celici. Da so preverili posledice prekomernega izražanja rexB, so spremenili lizogen λ CR63(λ) z rexB izražajočim vektorjem pBS rexB phoA' in opazovali izločanje r638, ki je fag T4 z izbrisom na lokusu rII. Za kontrolo so uporabili še vektorje pBS in pBS phoA', ki ne povzročijo prekomernega izražanja rexB in normalen fag λ. Ugotovili so, da prekomerno izražanje rexB v lizogenu prepreči izločanje rII mutantov. Kot pričakovano vektorji brez gena za RexB (pBS in pBS phoA') niso preprečili izločanja rII mutantov. S tem so dokazali, da fag λ najverjetneje za preprečitev samoizključitve pri vstopu v litično fazo izkorišča namnoževanje proteina RexB in s tem povzroči njegovo deaktivacijo. Kasneje so ugotovili, da je za povečanje količine RexB zaslužen promotor pLIT, ki se aktivira samo med razvojem faga λ.

VIRI

• Labrie, S. J. et. al. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 2010, let. 8, str. 317-327.
• Slavcev, R.A. The Bacteriophage λ Rex-Centric Mutualism Phenotype, Conditional Rex, and Other Novel Rex Phenotypes. 2002
• Parma, D.H., Snyder, M., Sobolevski, S., Nawroz, M., Brody, E., Gold, L. The Rex system of bacteriophage k: tolerance and altruistic cell death. GENES & DEVELOPMENT, 1992, 6, 497-510.
• Snyder, L. Phage-exclusion enzymes: a bonanza of biochemical and cell biology reagents? Molecular Microbiology, 1995, 15(3), 415-420.
• Snyder, L., McWilliams, K. The rex genes of bacteriophage lambda can inhibit cell function without phage superinfection. Gene, 1989, str. 17-24.