Proizvodnja n-butanola in etanola iz celuloze v bakteriji Clostridium cellulovorans s prekomernim izražanjem aldehid in alkohol dehidrogenaz

Živimo v času velike potrošnje in z njo povezano veliko količino odpadnih surovin, s katerimi se ne znamo dovolj dobro spopasti. Predelava odpadnih surovin v mikroorganizmih ima velik potencial in je tudi zelo privlačna. Iz poceni odpadnih surovin lahko namreč pripravimo produkte z visoko dodano vrednostjo, kot so biogoriva. V kolikor so odpadne surovine tudi obnovljive, to predstavlja še dodatno prednost napram konvencionalnim virom energije<ref name="ena">J. F. Wang, X. R. Yang, C. C. Chen in S. T. Yang: Engineering clostridia for butanol production from biorenewable resources: from cells to preocess integration. Curr. Opin. Chem. Eng. 2014, 6, 43-54.</ref>.

Pridelava alifatskih alkoholov v Clostridium cellulovorans

Cilj avtorjev, na delu katerih temelji ta seminar, je bila priprava mikroorganizma, ki bi proizvajal zadostne količine butanola, kot edini vir ogljika pa bi uporabljal celulozo. Butanol je obetavno biogorivo, ker ima primerljivo energijsko gostoto s fosilnimi gorivi in ne zahteva modifikacij motorjev z notranjim izgorevanjem<ref name="ena">. Kot odskočno desko so si izbrali bakterijo Clostridium cellulovorans. Kot namiguje že njeno ime, ima celulolitično aktivnost, kar ji omogoča rast v prisotnosti celuloze kot edinega vira ogljika. V sorodni bakteriji Clostridium acetobutylicum, ki velja za modelni mikroorganizem za preučevanje fermentacije, pri kateri nastajajo aceton, etanol in butanol (angl. fermentation acetone-butanol-ethanol) so bili že karakterizirani encimi, ki ji omogočajo takšen metabolizem. Zato so iz njenega genoma pomnožili zapise za tri encime – AdhE1, AdhE2 in BdhB. AdhE1 je od NADH odvisna butiraldehid dehidrogenaza, AdhE2 je bifunkcionalna od NADH odvisna alkohol in aldehid dehidrogeneza, BdhB pa je od NADPH odvisna butanol dehidrogenaza. Zapise so z ekspresijskim vektorjem pYL0001 prenesli v C. cellulovorans v treh različnih kombinacijah – AdhE2, fuziji AdhE1-BdhB in fuziji AdhE2-BdhB (od zdaj naprej sevi adhE1, adhE1-bdhB in adhE2-bdhB) <ref name="dve">T. Bao, J. Zhao, J. Li, X. Liu in S. T. Yang: n-butanol and ethanol production from cellulose by Clostridium cellulovorans overexpressing heterologous aldehyde/alcohol dehydrogenases. Bioresourc. Technol. 2019, 285.</ref>.

Uspešnost in obseg izražanja encimov so kvantificirali z encimskimi testi v prisotnosti ustreznega kofaktorja in substrata. V vsaki kombinaciji zapisov so opazili približno desetkrat večjo butiraldehid dehidrogenazno in butanol dehidrogenazno aktivnost v primerjavi z divjim tipom. Encimskim testom je sledila saržna fermentacija z glukozo kot edinim virom ogljika. Vsi sevi razen divjega tipa so uspešno proizvajali etanol in butanol v različnem obsegu in razmerjih. Sev adhE2 je v največji meri proizvajal etanol (2,14 g/L) in n-butanol (1,76 g/L). V primerjavi z divjim tipom je proizvajal dvakrat več etanojske kisline, saj je s tem kompenziral energijske izgube zaradi redukcije butiraldehida v butanol. Sev adhE2-bdhB je v nekoliko manjši meri proizvajal n-butanol (1,66 g/L), etanola pa skoraj nič. Sev adhE1-bdhB je prav tako v nekoliko manjši meri proizvajal n-butanol (1,47 g/L) in zelo malo etanola (0,21 g/L). Pri sevih adhE1 bdhB in adhE2-bdhB je bila proizvodnja butanojske kisline bistveno večja kot pri sevu adhE2, kar nakazuje na njegovo visoko učinkovitost pretvorbe butanojske kisline in butiraldehida v n-butanol <ref name="dve"/>.

Saržni fermentaciji z glukozo je sledila še saržna fermentacija s celulozo kot edinim virom ogljika. Proizvodnja alifatskih alkoholov je bila primerjavi s prvo saržno fermentacijo skoraj nespremenjena. Sev adhE2 je ponovno v največji meri proizvajal n-butanol (2,0 g/L) in etanol (2,0 g/L). Za razliko od prve fermentacije, pa v tej fermentaciji ni proizvajal dvakrat več etanojske kisline kot divji tip. Sev adhE2-bdhB je v dvakrat manjši meri proizvajal n-butanol (1,12 g/L) in etanol (0,92 g/L). Sev adhE1-bdhB je tako kot v prvi saržni fermentaciji v nekoliko manjši meri proizvajal n-butanol (1,11 g/L) in zelo malo etanola (0,20 g/L). Izmed vseh treh sevov se je sev adhE2 najbolje izkazal za proizvodnjo butanola, tako iz glukoze kot celuloze. Zato so s tem sevom izvedli poskusno fermentacijo v večjem merilu. Po dvanajstnih dneh so dosegli koncentracijo 4 gramov butanola na liter gojišča, z izkoristkom 0,22 grama butanola na gram celuloze. V naslednjih poskusih so v gojišče dodali še metil viologen, umetno elektron donorsko spojino, ki poveča razpoložljivost NADH, med drugim tudi za biosintezo alkoholov. S tem so za skoraj trikrat povečali proizvodnjo etanola, proizvodnja butanola pa se ni spremenila. Sklepajo, da je to posledica substratne selektivnosti AdhE2, saj ta reducira tako butirat kot tudi acetat<ref name="dve"/>.

Vpliv vnešenih encimov na metabolni pretok

Avtorji so preverili tudi vpliv vnešenih encimov na ogljikov metabolni pretok. V primerjavi z divjim tipom, se je v sevu adhE2 povečal metabolni pretok proti proizvodnji alkoholov, predvsem proti proizvodnji etanola. V sevih adhE1-bdhB in adhE2-bdhB pa se je bistveno zmanjšal metabolni pretok proti proizvodnji etanola, vendar se ni preusmeril proti proizvodnji butanola, temveč butirata. V sevu adhE2 se je spremenil tudi metabolni pretok proizvodnje elektron donorskih spojin. V primerjavi z divjim tipom in sevoma adhE1-bdhB in adhE2-bdhB je bila proizvodnja NADH bistveno večja, kar je pripomoralo k visoki sintezi butanola<ref name="dve"/>.

Zaključek

Delo avtorjev predstavlja pomemben korak proti proizvodnji biogoriv iz odpadnih surovin z mikroorganizmi. Sami opozarjajo in se zavedajo, da je pred njimi še ogromno dela, saj trenuten sev ne omogoča profitabilnega procesa. V nadaljevanju bi morali optimizirati številne procese na nivoju celice. Poleg povečanja celulolitične aktivnosti, bi bilo nujno potrebno še dodatno povečati metabolni pretok proti proizvodnji butanola, saj je za finančno izvedljivost potrebna proizvodnja vsaj 10 gramov butanola na liter gojišča oziroma 0,3 grama butanola na gram celuloze. To je po mnenju avtorjev dosegljivo z uvedbo dodatnih encimov in metabolnega inženiringa<ref name="dve"/>.

Viri

<references/>