Proizvodnja n-butanola in etanola iz celuloze v bakteriji Clostridium cellulovorans s prekomernim izražanjem aldehid in alkohol dehidrogenaz

Živimo v času velike potrošnje in z njo povezano veliko količino odpadnih surovin, s katerimi se ne znamo dovolj dobro spopasti. Predelava odpadnih surovin v mikroorganizmih ima velik potencial in je tudi zelo privlačna. Iz poceni odpadnih surovin lahko namreč pripravimo produkte z visoko dodano vrednostjo, kot so biogoriva. V kolikor so odpadne surovine tudi obnovljive, to predstavlja še dodatno prednost napram konvencionalnim virom energije<ref name="ena">J. F. Wang, X. R. Yang, C. C. Chen in S. T. Yang: Engineering clostridia for butanol production from biorenewable resources: from cells to preocess integration. Curr. Opin. Chem. Eng. 2014, 6, 43-54.</ref>.

Proizvodnja alifatskih alkoholov v Clostridium cellulovorans

Cilj avtorjev, na delu katerih temelji ta seminar, je bila priprava mikroorganizma, ki bi proizvajal zadostne količine n-butanola, kot edini vir ogljika pa bi uporabljal celulozo. n-Butanol je obetavno biogorivo, ker ima primerljivo energijsko gostoto s fosilnimi gorivi in ne zahteva modifikacij motorjev z notranjim izgorevanjem<ref name="ena"/>. Kot odskočno desko so si izbrali bakterijo Clostridium cellulovorans. Kot namiguje že njeno ime, ima celulolitično aktivnost, kar ji omogoča rast v prisotnosti celuloze kot edinega vira ogljika. V sorodni bakteriji Clostridium acetobutylicum, ki velja za modelni mikroorganizem za preučevanje fermentacije, pri kateri nastajajo aceton, etanol in butanol (angl. fermentation acetone-butanol-ethanol) so bili že karakterizirani encimi, ki ji omogočajo takšen metabolizem. Zato so iz njenega genoma pomnožili zapise za tri encime – AdhE1, AdhE2 in BdhB. AdhE1 je od NADH odvisna butiraldehid dehidrogenaza, AdhE2 je bifunkcionalna od NADH odvisna alkohol in aldehid dehidrogeneza, BdhB pa je od NADPH odvisna butanol dehidrogenaza. Zapise so z ekspresijskim vektorjem pYL0001 prenesli v C. cellulovorans v treh različnih kombinacijah – AdhE2, fuziji AdhE1-BdhB in fuziji AdhE2-BdhB (od zdaj naprej sevi adhE1, adhE1-bdhB in adhE2-bdhB)<ref name="dve">T. Bao, J. Zhao, J. Li, X. Liu in S. T. Yang: n-butanol and ethanol production from cellulose by Clostridium cellulovorans overexpressing heterologous aldehyde/alcohol dehydrogenases. Bioresourc. Technol. 2019, 285.</ref>.

Uspešnost in obseg izražanja encimov so kvantificirali z encimskimi testi v prisotnosti ustreznega kofaktorja in substrata. V vsaki kombinaciji zapisov so opazili približno desetkrat večjo butiraldehid dehidrogenazno in butanol dehidrogenazno aktivnost v primerjavi z divjim tipom. Encimskim testom je sledila saržna fermentacija z glukozo kot edinim virom ogljika. Vsi sevi razen divjega tipa so uspešno proizvajali etanol in n-butanol v različnem obsegu in razmerjih. Sev adhE2 je v največji meri proizvajal etanol (2,14 g/L) in n-butanol (1,76 g/L). V primerjavi z divjim tipom je proizvajal dvakrat več etanojske kisline, saj je s tem kompenziral energijske izgube zaradi redukcije butiraldehida v n-butanol. Sev adhE2-bdhB je v nekoliko manjši meri proizvajal n-butanol (1,66 g/L), etanola pa skoraj nič. Sev adhE1-bdhB je prav tako v nekoliko manjši meri proizvajal n-butanol (1,47 g/L) in zelo malo etanola (0,21 g/L). Pri sevih adhE1 bdhB in adhE2-bdhB je bila proizvodnja butanojske kisline bistveno večja kot pri sevu adhE2, kar nakazuje na njegovo visoko učinkovitost pretvorbe butanojske kisline in butiraldehida v n-butanol<ref name="dve"/>.

Saržni fermentaciji z glukozo je sledila še saržna fermentacija s celulozo kot edinim virom ogljika. Proizvodnja alifatskih alkoholov je bila primerjavi s prvo saržno fermentacijo skoraj nespremenjena. Sev adhE2 je ponovno v največji meri proizvajal n-butanol (2,0 g/L) in etanol (2,0 g/L). Za razliko od prve fermentacije, pa v tej fermentaciji ni proizvajal dvakrat več etanojske kisline kot divji tip. Sev adhE2-bdhB je v dvakrat manjši meri proizvajal n-butanol (1,12 g/L) in etanol (0,92 g/L). Sev adhE1-bdhB je tako kot v prvi saržni fermentaciji v nekoliko manjši meri proizvajal n-butanol (1,11 g/L) in zelo malo etanola (0,20 g/L). Izmed vseh treh sevov se je sev adhE2 najbolje izkazal za proizvodnjo n-butanola, tako iz glukoze kot celuloze. Zato so s tem sevom izvedli poskusno fermentacijo v večjem merilu. Po dvanajstnih dneh so dosegli koncentracijo 4 gramov n-butanola na liter gojišča, z izkoristkom 0,22 grama n-butanola na gram celuloze. V naslednjih poskusih so v gojišče dodali še metil viologen, umetno elektron donorsko spojino, ki poveča razpoložljivost NADH, med drugim tudi za biosintezo alkoholov. S tem so za skoraj trikrat povečali proizvodnjo etanola, proizvodnja n-butanola pa se ni spremenila. Sklepajo, da je to posledica substratne selektivnosti AdhE2, saj ta reducira tako butirat kot tudi acetat<ref name="dve"/>.

Vpliv vnešenih encimov na metabolni pretok

Avtorji so preverili tudi vpliv vnešenih encimov na ogljikov metabolni pretok. V primerjavi z divjim tipom, se je v sevu adhE2 povečal metabolni pretok proti proizvodnji alkoholov, predvsem proti proizvodnji etanola. V sevih adhE1-bdhB in adhE2-bdhB pa se je bistveno zmanjšal metabolni pretok proti proizvodnji etanola, vendar se ni preusmeril proti proizvodnji n-butanola, temveč butirata. V sevu adhE2 se je spremenil tudi metabolni pretok proizvodnje elektron donorskih spojin. V primerjavi z divjim tipom in sevoma adhE1-bdhB ter adhE2-bdhB je bila proizvodnja NADH bistveno večja, kar je pripomoralo k visoki sintezi butanola<ref name="dve"/>.

Zaključek

Delo avtorjev predstavlja pomemben korak proti proizvodnji biogoriv iz odpadnih surovin z mikroorganizmi. Sami opozarjajo in se zavedajo, da je pred njimi še ogromno dela, saj trenuten sev ne omogoča profitabilnega procesa. V nadaljevanju bi morali optimizirati številne procese na nivoju celice. Poleg povečanja celulolitične aktivnosti, bi bilo nujno potrebno še dodatno povečati metabolni pretok proti proizvodnji n-butanola, saj je za finančno izvedljivost potrebna proizvodnja vsaj 10 gramov n-butanola na liter gojišča oziroma 0,3 grama n-butanola na gram celuloze. To je po mnenju avtorjev dosegljivo z uvedbo dodatnih encimov in metabolnega inženiringa<ref name="dve"/>.

Viri

<references/>