Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v E.coli.

Zdravljenje duševnih motenj

Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. 2016, 3(7), 619–627. </ref>.

Psilocibin

Psilocibin je psihedelična spojina, ki je sintetizirana iz triptofana in je produkt različnih gob iz rodu Psilocybe. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. 2017, 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. 2019, 25(4), 897–903.</ref> .

Magi. Coli

V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v E.coli, da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, ki jih najdemo v biosintetski poti Psilocybe cubensis. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH je bil vključen v drug plazmid, da bi bil sočasno izražen z drugimi geni. Po pridobljenem sistemu Magi.Coli so ga želeli še izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E.coli. Želeli so optimizirati kodone, da bi izboljšali sintezo funkcionalnih proteinov zlasti PsiH. To so poskušali na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive Neurospora crassa.

Izvedba eksperimentov

Izražanje genov psiK, psiD in psiM v posameznih konstruktih

Prvi uspešen korak je bil kloniranje psiK (BBa_K3140002), psiD (BBa_K3140000) in psiM (BBa_K31440003) genov v plazmidu pET28. Z ustreznimi restriktazami so rezali pET28 plazmide, da so vstavili posamezen gen in ligirali. Celice E.coli BL21 [DE3] so transformirali s plazmidom. Celične lizate so nanesli na SDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da oblikujejo plazmid pET28 z dodatnim plazmidom pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo afinitetne kromatografije z nikljem. Funkcionalnosti vzorcev so preverili s pomočjo kvalitativnega testa LCMS. Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

Sestavljanje genskega grozda (gene cluster) psiK, psiD, psiM

Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Vse skupaj so transformirali v celice E.coli DH5α s pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Sledila je suspenzija celic ter inkubacija s stresanjem. Supernatant so očistili in identificirali produkte presnove z LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze Baeocistina. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, pogojev in uporabe proteina, uporaba PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje fenotipa proizvedenih proteinov.

Izražanje in karakterizacija PsiH encima

V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 (BBa_K3140001), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 (BBa_K3140004), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v E.coli so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice E.coli za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v E. coli. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

Nastanek dvoplazmidnega sistema

S tem, ko so vstavili dva plazmida v iste celice, je bila ustvarjena celotna pot iz gob v E.coli. Transformirali so celice E.coli DH5α s pGro7 s pUS382 in pUS387, to so imenovali Magi.coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo do srednje dolge faze. PUS382 so inducirali z IPTG in pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo, da so preverili prisotnost intermediatov na poti.

Gojenje

Namen tega dela je bil raziskati in primerjati rast v dveh ločenih sistemih. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za izražanje v fermentorju.

Optimizacija

Optimizacija kodonov

Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona (BBa_K3140006, BBa_K3140007,BBa_K3140008, BBa_K3140009). Optimizacijo bi uporabili za usklajevanje kodonov psi genov za izboljšanje izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodona morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

PCR nagnjen k napakam

S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescenčnega proteina VVD. Rezultati sekvenciranja teh VVD genov iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Ta mutacija je metionin v ostanku 130 spremenila v izolevcin, treonin ali levcin, izboljšala se je fluorescenca proteina (BBa_K31440010).

Zaključek

Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v E.coli so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

Viri

<references/>