User:Žiga Vičič
The real MVP je študentski projekt, s katerim je ekipa tehniške univerze v Darmstadtu nastopila na tekmovanju iGEM 2019. Cilj projekta je priprava ekspresijskega sistema, s katerim bi lahko pripravili modularne virusom podobne delce za enostavno pripravo dostavnih sistemov<ref>iGEM 2019 team TU Darmstadt. The real MVP. [citirano 18.4.2020] https://2019.igem.org/Team:TU_Darmstadt</ref>.
Virusom podobni delci
Virusom podobni delci so nanodelci, ki nastanejo s spontano sestavo virusne kapside. Čeprav so podobni virusom se od njih razlikujejo v tem, da ne vsebujejo DNA oziroma RNA. Kljub temu so zmožni vstopiti v tarčne celice. Interes za nove virusom podobne delce je spodbudil uspešen razvoj cepiva proti virusu hepatitisa B, k čemur so pripomogli 22 nm veliki prazni delci sestavljeni iz proteinov virusnega plašča, ki so jih znanstveniki uspeli izolirati iz z virusom okuženih celic<ref>C. Ludwig, R. Wagner: Virus-like particles–universal molecular toolboxes. In "Current opinion in Biotechnology"; Elsevier Ltd. 2007, "18", 537–545.</ref>.
The real MVP
Študentje so želeli pripraviti ekspresijski sistem za pripravo virusom podobnih delcev, kjer so želeli plaščnim proteinom dodati C-končni prepoznavni motiv sortaze A, ta pa bi nato omogočala pripenjanje poljubnih, N-končno označenih proteinov. Delce so želeli pripraviti in vitro ter in vivo, jih očistiti in določiti njihove lastnosti.
Priprava virusom podobnih delcev in vitro
Za sestavo virusom podobnih delcev so izbrali kapsidne proteine bakteriofaga P22, ki jih sestavljajo ponavljajoča se plaščni in ogrodni protein. Gen za plaščni protein z dodanim C-končnim zaporedjem LPETGG so z restrikcijo in ligacijo vstavili v plazmid pET24 (BBa_K3187000) ter z metodo lepljenja po Gibsonu v plazmid pACYCT2 vnesli zapisa za ogrodni protein in super-zvito obliko zelenega fluorescirajočega proteina (sfGFP) (BBa_K3187003). Tako pripravljene plazmide so vstavili v celice BL21[DE3]. Proteine so izrazili prek induktivnega promotorja T7 in ga očistili s hitro tekočinsko proteinsko kromatografijo z uporabo sistema Strep-tag II ter okarakterizirali z metodo prenosa Western.
Tako pripravljena fuzijski protein sfGFP-SP in CP so združili v molskem razmerju 1:2,8 ter VLP-je ločili z grandientnim centrifugiranjem skozi saharozo na ultracentrifugi. Usedle delce so zaznali preko fluorescence ter velikost 60 nm kapsid določili s presevnim elektronskim mikroskopom (TEM).
Priprava virusom podobnih delcev in vivo
Za sestavo VLP in vivo so bakterije seva BL21[DE3] kotransformirali s plazmidom pET24 z zapisom za CP-LPETGG in plazmidom pACYCT2 z zapisom za sfGFP-SP. Sestavljene VLP so izolirali prek lize celic s sonifikacijo in centrifugiranjem. V nadaljevanju so VLPje ločili z gradientnim centrifugiranjem skozi saharozo na ultracentrifugi. Za odstranitev endotoksinov so uporabili velikostno izključitveno kromatografijo ter velikost 60 nm VLP potrdili s TEM.
Endotoksini pri in vivo proizvodnji
Endotoksini so pirogeni, ki v in vivo lahko sprožijo številne biološke odzive, zaradi česar je potrebno, da se jih iz končnih produktov odstrani. Za določitev ravni endotoksinov v P22-VLP proizvedenih in vivo ter in vitro so uporabili LAL test. Izoliranim P22-VLP proizvedeni in vitro so določili nizko raven prisotnih endotoksinov, pri tistih proizvedenih in vivo pa je bila raven previsoka, kar bi v nadaljevanju zahtevalo izbolšavo izolacije.
Določanje velikosti kapsid
S slikanjem s presevnim elektronskim mikroskopom je ekipa študentov določila velikosti VLP 57 nm ± 3 nm. Za meritve velikosti večjega števila VLP so uporabili tehniko dinamičnega sipanja svetlobe, vendar je ta meritev dala rezultate s približno 50 nm odstopanja, a je hkrati potrdila, da je sistem monodisperzen.
Kapside zgrajene le iz plaščnih proteinov
Ekipi je uspelo pripraviti tudi VLP sestavljene iz kapsid, ki so jih tvorili le plaščni proteini. Velikost le-teh so okarakterizirali s presevnim elektronskim mikroskopom, pri čemer so jim določili velikost 53 nm ± 4,3 nm, kar kaže, da so tako nastali VLP nekoliko manjši.
Sortaze
Sortaze so encimi, ki spadajo v družino transpeptidaz in jih najpogosteje najdemo v gram-pozitivnih bakterijah. Njihova vloga je pripenjanje površinskih proteinov s pravim pentapeptidnim C-končim motivom na celično steno bakterij. Glede na prepoznavni motiv jih delimo v tri skupine, sortaze A, B in C, ki jim je skupno zaporedje aminokislin TLXTC v aktivnem mestu ter nekaj posameznih pozitivno nabitih ostankov<ref>K. W. Clancy, J. A. Melvin, D. G. McCafferty: Sortase transpeptidases: Insights into mechanism, substrate specificity, and inhibition. In "Peptide Science"; Wiley Periodicals, Inc. 2010, "94", 385–396.</ref>.
Sortazi A5M in A7M
Študentje so uporabili sortaze razreda A iz bakterije Staphylococcus aureus, ki pripenjajo glikoproteine na površino celic. Encime sestavlja osem β-ploskev, ki tvorijo β-sodček. Aktivnost encimov tega razreda se poveča z vezavo kalcija na aminokislinske ostanke zanke, ki povezuje ploskvi β6 in β7. Reakcijo sproži kovalentna vezava C-končnega LPETG motiva substrata v aktivno mesto encima. CIsteinski ostanek 184 napade peptidno vez med glicinom in treoninom, protoniran histidinski ostanek sortaze na mestu 120 omogoči protonacijo NH2 skupine glicine ter s tem odcep te aminokisline od zaporedja. Nato drug glicin kot nukleofil lahko napade nastalo tioestrsko skupino. Glede na to, da so v aktivnem mestu aminokisline protonirane, je reakcija močno odvisna od pH. Sortaze A so katalitično aktivne v območju pH od 3 do 11, optimalno pa delujejo pri pH 8.
V projektu je ekipa uporabila sortazo A5M, ki je izvedba sortaze A s petimi mutacijami (P94R, D160N, D165A, K190E in K196T), ki vplivajo na 140-kratno povišano katalitično aktivnost. Ker pri in vivo pogojih ravni Ca2+ ionov, od katerih je odvisna aktivnost sortaz A, močno variirajo, so preiskusili tudi sortazo A7M, ki ni odvisna od prisotnosti kalcijevih ionov.
Zapisa za sortazi A5M (BBa_K3187016) in A7M (BBa_K3187028) je ekipa z restrikcijskimi endonukleazami NdeI in SalI ter tehniko lepljenja po Gibsonu vstavila v vektor pET24(+). Vektor vsebuje gen za rezistenco na kanamicin ter inducibilen promotor T7. Pripravljene plazmide so izrazili v celicah BL21[DE3]. Encime so izolirali s homogenizacijo celic z EmulsiFlex in afinitetno kromatografijo z oznakami His-Tag in Strep-Tag II. Velikost encimov so določili na gelu NaDS-PAGE ter okarakterizirali lastnosti sortaz prek analize Fösterjevega resonančnega prenosa energije (FRET). Aktivnost encimov so preverili s katalitično povezavo proteina TAMRA s C-končno oznako LPETG in sfGFP z N-končno oznako GGGG, pri čemer so zaznali prenos fluorescence z enega na drugi fluorofor, kar je potrdilo, da sta tako pripravljena encima aktivna.
Pripenjanje na plaščni protein bakteriofaga P22
S sortazo A7M je ekipa uspešno katalizirala reakcijo pripenjanja GGGG-mCherry na CP-LPETGG pri čemer so na gelu NaDS-PAGE zaznali lise pri dolžini predvideni za velikost produkta (28 kDa + 49 kDa = 77 kDa). Vendar je bilo prisotnih tudi več lis, ki jih niso uspeli okarakterizirati in so jih pripisali povezavam med prostimi proteini CP-LPETGG ter GGGG-mCherry.
Modeliranje
Struktura encima sortaze A7M ni znana, zato se je skupina študentov odločila, da z metodami molekulskega modeliranja določi najverjetnejšo strukturo temu encimu. Uporabili so pristope strojnega učenja, ki jih je pred tem opisal Mohammed AlQuraishi in ki naj bi zagotavljali napake znotraj 2 Å, pri čemer pristop zahteva bistveno manj računske moči<ref>M. AlQuraishi: End-to-End Differentiable Learning of Protein Structure. In "Cell Systems"; Elsevisier Ltd. 2019, "8", 292–301.</ref>. Rezultate modela so ovrgli, saj so ti kazali na odsotnost vseh sekundarnih struktur. Bolj uspešni so bili z uporabo programskega paketa RosettaCM, kjer so z metodami simulacij molekulskega modeliranja uspeli izbrati najverjetnejšega kandidata za opis 3D strukture encima.
Priprava modularnega ekspresijskega sistema
Za razširitev uporabnosti sistema VLP je ekipa želela razviti ekspresijski mehanizem, ki bi omogočal pripravo delcev z različnim razmerjem med modificiranimi in nemodificiranimi plaščnimi proteini. Načrtali so dvojni ekspresijski vektor, kjer sta bila zapisa za sfGFP pod vplivom promotorja T7 in zapisa za mCherry pod vplivom tetA promotorja vnesena v plazmid pTeTW3con2 (BBa_K3187011) . S spreminjanjem koncentracij induktorjev izopropil ß-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) in anhidrotetraciklina (AHT) so določevali nivo izražanja posameznih genov. Ugotovili so, da sta intenziteti proteinov mCherry in sfGFP po prekonočnem izražanju v prisotnosti 0,2 µg/mL induktorja AHT enaki, pri čemer so nepričakovano izražanje gena za sfGFP pripisali spremembi sekundarne strukture plazmida ob vezavi induktorja AHT. V nadaljevanju so okarakterizirali proces izražanja genov v prisotnosti zgolj enega induktorja. Podatke glede razmerja fluorescence proteinov mCherry in sfGFP v odvisnosti od dodane koncentracije AHT so uporabili za prileganje modelne funkcije in pripravo nastavitev bioreaktorja.
Načrtali so tudi plazmid pTeTW3con2 v katerega bi vstavili zaporedje, kjer bi promotor T7 nadziral izražanje plaščnega in ogrodnega proteina bakteriofaga P22, tetA promotor pa bi nadziral izražanje plaščnega proteina s C-končno oznako LPETGG (BBa_K3187013). Na ta način bi z različnimi koncentracijami dodanih induktorjev IPTG in AHT lahko nadzirali, koliko CP z oznako LPETGG bi se vgradilo v VLP.
Viri
<references/>
