Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki

Povzeto po članku: Ausländer, S., Ausländer, D., Müller, M., Wieland, M. & Fussenegger, M. Programmable single-cell mammalian biocomputers. Nature 487, 123–127 (2012).

Prenos informacij v sodobnih elektronskih napravah poteka s pomočjo elektronov, vhodne signale pa obdelajo in uskladijo binarna logična vrata znotraj stikalne plošče. To omogoča enostavno izvrševanje poljubnih algoritmov in s tem izdelavo računalnikov z visoko zmogljivostjo procesiranja. Računalnikom podobne »naprave« pa najdemo že tudi v naravi: celice, ki neprestano izvajajo veliko število fizioloških procesov, s katerimi usklajujejo zunaj- in znotrajcelične signale ter skrbijo za pravilno odzivanje oz. izhodne signale. To jim omogočajo genetska vezja, ki za razliko od električnih za prenos informacij uporabljajo kemične signale¹.

Sintezna biologija je s standardiziranim in skrbno načrtanim sestavljanjem delov genetskih vezij, ki temeljijo na inducibilnem nadzoru transkripcije in translacije v celici, močno pospešila napredek pri izdelavi zahtevnejših sintetičnih vezij z želenimi lastnostmi. Sintetična vezja pa so uporabna šele, ko jih vgradimo v celice, pri čemer se je izkazalo, da lahko za to uporabimo tako bakterije in kvasovke kot tudi sesalske celice. Napoved, kako se bodo komponente genetskih vezij v celici obnašale, je praktično nemogoča, še posebej če je komponent veliko – delovati morajo neodvisno ena od druge in povsem ločeno od celičnega metabolizma. Poenostavljeno lahko posamezne komponente vezja vgradimo v ločene celice, ki se med seboj sporazumevajo z zunajceličnimi signali, pripravljeni pa so bili že tudi povsem samostojni enocelični bioračunalniki^2,3.

Priprava enoceličnih sesalskih bioračunalnikov

Leta 2012 je skupina iz Švice pripravila serijo enoceličnih sesalskih bioračunalnikov s sposobnostjo procesiranja dveh vhodnih signalov naenkrat. S kombiniranjem regulatorjev transkripcije in translacije so ustvarili logična vrata NE, IN, NE-IN, IN-NE in IZKLJUČUJOČI ALI, z nadaljnjim kombiniranjem logičnih vrat pa so sestavili tudi polovični odštevalnik in polovični seštevalnik. Sintetična genetska vezja so vnesli v človeške embrionalne ledvične celice (HEK 293) s prehodno kotransfekcijo z do sedmimi ločenimi vektorskimi konstrukti hkrati. Transfeciranim celicam so dodali kombinacijo vhodnih signalov in po 62 urah merili izhodni signal z ločevalnikom fluorescenčno označenih celic (FACS).

Osnovne komponente vezij

Vezja so v osnovi sestavljena iz treh delov, in sicer iz vhodnih signalov, enote za obdelavo podatkov in vsaj enega izhodnega signala. V opisani študiji sta bila vhodna signala dve organski molekuli: antibiotik eritromicin in fenol iz listov jablane, floretin, izhodna signala pa dva reporterska proteina: labilen rumeni fluorescenčni protein d2EYFP in labilen rdeči fluorescenčni protein dsRed.

Obdelava podatkov je potekala tako na ravni transkripcije kot translacije. Transkripcijo so nadzirali z uporabo dveh dvodomenskih sintetičnih aktivatorjev, katerih prva domena prepoznava operator tarčnega minimalnega promotorja v odvisnosti od vezave specifičnega vhodnega signala, druga pa sproži transkripcijo: od eritromicina odvisen transaktivator ET1, ki se veže na promotor P_ERT2, in od floretina odvisen transaktivator TtgA₁, ki se veže na promotor P_TtgR1. Oba transaktivatorja se vežeta in spodbujata transkripcijo v odsotnosti kemičnega signala, v prisotnosti pa ne. Za uravnavanje translacije so izbrali dva RNA-vezavna proteina: bakteriofagni plaščni protein MS2, ki se veže na RNA-motiv MS2_box, in ribosomalni protein L7Ae iz arhej, ki prepoznava RNA-motiv C/D_box. Zapisa za motiva MS2_box in C/D_box se v vezjih nahajata navzgor od zapisov za reporterska proteina in sta po transkripciji del 5'-neprevedene regije mRNA. Vezava RNA-vezavnega proteina na tarčni RNA-motiv onemogoči translacijo reporterskega proteina.

Logične operacije

Premišljena kombinatorika le štirih transkripcijskih oz. translacijskih regulatornih parov znotraj enote za procesiranje je omogočila pripravo različnih vezij z do šestimi enotami za izražanje. Prisotnost (1) ali odsotnost (0) eritromicina in/ali floretina sta prevedeni v merljiv izhodni signal VKLOP (1) ali IZKLOP (0), v primeru sestavljanja logičnih vrat pa v seštevek oz. razliko vhodnih signalov.

NE

Logična vrata NE so bila pripravljena za vsako izmed vhodnih molekul posebej in so dejansko odvisna le od enega izmed obeh vhodnih signalov. Vezje NE-floretin je tako sestavljeno iz transaktivatorja TtgA₁, ki se izraža konstitutivno. V odsotnosti floretina se TtgA₁ veže na operator promotorja PTtgR1 in aktivira transkripcijo konstrukta C/D_box-d2EYFP-p(A), pri čemer p(A) predstavlja poliadenilacijski signal. Drugi vhodni signal, eritromicin, prek transaktivatorja ET1 nadzira izražanje proteina MS2, ki pa motiva C/D_box ne prepoznava – poti med seboj nista sklopljeni. Reporterski protein d2EYFP se torej izraža v odsotnosti floretina in prisotnosti ali odsotnosti eritromicina, v prisotnosti floretina pa ne (tabela 1).

Tabela 1: Pravilnostna tabela NE-floretin.

eritromicin	floretin	d2EYFP
0	0	1
1	0	1
0	1	0
1	1	0

Ker pari uporabljenih transkripcijskih in translacijskih regulatorjev delujejo na enak način, je vezje NE-eritromicin v osnovi enako kot vezje NE-floretin, le da vlogo TtgA₁ nadomesti ET1, ki nadzira prepis konstrukta MS2_box-d2EYFP-p(A), TtgA₁ pa deluje v neodvisni poti, ki nadzira izražanje L7Ae.

IN

Logična vrata IN so iz dveh medsebojno povezanih delov. Konstitutivno izražen TtgA₁ aktivira izražanje MS2, konstitutivno izražen ET1 pa izražanje L7Ae. Konstitutivno se prepisuje tudi konstrukt MS2_box-C/D_box-dsRed-p(A), katerega translacija je zaradi vezave MS2 in L7Ae na oba RNA-motiva navzgor od zapisa za reporterski protein onemogočena. Šele v primeru odsotnosti obeh RNA-vezavnih proteinov se reporterski protein dejansko izraža – to se zgodi v primeru inaktivacije tako TtgA₁ kot ET1, torej v prisotnosti eritromicina in floretina (tabela 2).

Tabela 2: Pravilnostna tabela IN.

eritromicin	floretin	dsRed
0	0	0
1	0	0
0	1	0
1	1	1

IN-NE

Z logičnimi vrati IN-NE (angl. N-IMPLY) lahko v celice vnesemo program, ki bo vrnil izhodni signal VKLOP le v primeru, ko celice zaznajo natanko en, specifičen vhodni signal. V primeru eritromicina in floretina imamo dve možnosti takšnih vrat: eritromicin IN-NE floretin in floretin IN-NE eritromicin.

Logična vrata eritromicin IN-NE floretin delujejo podobno kot logična vrata NE, le da sta poti eritromicina in floretina sklopljeni. TtgA₁ se izraža konstitutivno in nadzira transkripcijo konstrukta C/D_box-d2EYFP-p(A). ET1 nadzira izražanje proteina L7Ae, ki prepoznava motiv C/D_box in s tem prepreči translacijo konstrukta C/D_box-d2EYFP-p(A). Reporterski protein se tako lahko izraža le v primeru, da eritromicin utiša izražanje L7Ae, delovanje TtgA₁ pa zaradi odsotnosti floretina ni moteno (tabela 3).

Tabela 3: Pravilnostna tabela eritromicin IN-NE floretin.

eritromicin	floretin	d2EYFP
0	0	0
1	0	1
0	1	0
1	1	0

Na enak način delujejo vrata floretin IN-NE eritromicin: ET1 nadzira transkripcijo konstrukta MS2_box-d2EYFP-p(A), TtgA₁ pa izražanje MS2.

IZKLJUČUJOČI ALI

IZKLJUČUJOČI ALI je s stališča priprave genetskega vezja še posebej zahteven, saj mora dva vhodna signala uskladiti tako, da dobimo izhodni signal VKLOP samo v primeru, ko je prisotna le ena izmed vhodnih molekul, ne pa, ko sta prisotni obe (tabela 4). Predhodno so bila ta logična vrata pripravljena le v izvenceličnem vezju, ki temelji na obdelavi podatkov z deoksiribocimi⁴, in prek medcelične komunikacije v bakterijah³ in kvasovkah². Skupina iz Švice pa je pripravila delujoč IZKLJUČUJOČI ALI v sesalskih celicah tako, da je enostavno združila logična vrata eritromicin IN-NE floretin in floretin IN-NE eritromicin. Vsak izmed transaktivatorjev ima v takšnem vezju dve funkciji: TtgA₁ nadzira transkripcijo konstrukta C/D_box-d2EYFP-p(A) in izražanje MS2, ET1 pa nadzira transkripcijo konstrukta MS2_box-d2EYFP-p(A) in izražanje L7Ae. Reporterski protein je še vedno le eden in se prepisuje bodisi iz konstrukta C/D_box-d2EYFP-p(A) bodisi iz konstrukta MS2_box-d2EYFP-p(A), nikoli pa iz obeh hkrati – v odsotnosti obeh vhodnih molekul je translacija obeh mRNA-konstruktov onemogočena z RNA-vezavnima proteinoma, v pristnosti eritromicina in floretina se nobeden izmed mRNA-konstruktov sploh ne prepisuje, v prisotnosti le ene izmed vhodnih molekul pa se izražata en mRNA-konstrukt in en RNA-vezavni protein, ki tega mRNA-konstrukta ne prepoznava.

Tabela 4: Pravilnostna tabela IZKLJUČUJOČI ALI.

eritromicin	floretin	d2EYFP
0	0	0
1	0	1
0	1	1
1	1	0

Da bi določili prispevek posameznih komponent vezja k njegovemu obnašanju, so posamične dele odstranili. Po odstranitvi enega izmed zapisov za reporterski gen so nastala logična vrata IN-NE, po odstranitvi enega izmed transaktivatorjev so nastala logična vrata NE, po odstranitvi enega izmed RNA-vezavnih proteinov pa so nastala logična vrata NE-IN, ki vrnejo izhodni signal VKLOP vedno, razen v primeru hkratne prisotnosti obeh vhodnih signalov. Ti rezultati poudarjajo predvidljivost uporabljenih delov in možnost njihovega poljubnega kombiniranja.

Sestavljanje kompleksnejših operacij

V elektronskih računalniških vezjih se pogosto uporabljajo tudi operacije, ki dvobitne vhodne signale odštevajo ali seštevajo in vrnejo več kot en izhodni signal. Z uvedbo dveh različnih reporterskih proteinov (d2EYFP in dsRed hkrati) in z nadaljnjim sestavljanjem logičnih vrat IZKLJUČUJOČI ALI in IN-NE so ustvarili sesalske celice, ki so delovale kot polovični odštevalniki (tabela 5), z združevanjem logičnih vrat IZKLJUČUJOČI ALI in IN pa so celice delovale kot polovični seštevalniki (tabela 6). To je pomembno, ker lahko s tema dvema operacijama v digitalni elektroniki izvedemo tudi katerokoli drugo, bolj kompleksno operacijo.

Tabela 5: Pravilnostna tabela polovičnega odštevalnika.

eritromicin – floretin	d2EYFP (razlika)	dsRed (sposodek)
0 – 0	0	0
0 – 1	1	1
1 – 0	1	0
1 – 1	0	0

Tabela 6: Pravilnostna tabela polovičnega seštevalnika.

eritromicin + floretin	d2EYFP (vsota)	dsRed (prenos)
0 + 0	0	0
0 + 1	1	0
1 + 0	1	0
1 + 1	0	1

Pomen enoceličnih sesalskih bioračunalnikov

V predstavljeni študiji pripravljeni enocelični sesalski bioračunalniki so se izkazali za izjemno robustne, logična vezja niso vplivala na preživetje celic, prav tako ni prihajalo do interference med komponentami enote za obdelavo podatkov, zato je bilo celice mogoče enostavno »programirati«. Napredek v razvoju takšnih bioračunalnikov je izrednega pomena, saj imajo zaradi zmožnosti zaznavanja okolice in proizvajanja želenih izhodnih signalov velik terapevtski potencial – njihova učinkovitost je že bila dokazana tako na celičnih linijah kot na živalskih modelih, in sicer predvsem za zdravljenje bolezni metabolizma^5–11 in rakavih obolenj^12,13.

Viri

1. Bandyopadhyay, S. et al. Rewiring of genetic networks in response to DNA damage. Science 330, 1385–1389 (2010).

2. Regot, S. et al. Distributed biological computation with multicellular engineered networks. Nature 469, 207–211 (2011).

3. Tamsir, A., Tabor, J. J. & Voigt, C. A. Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical ‘wires’. Nature 469, 212–215 (2011).

4. Stojanović, M. N. & Stefanović, D. Deoxyribozyme-based half-adder. J. Am. Chem. Soc. 125, 6673–6676 (2003).

5. Kemmer, C. et al. Self-sufficient control of urate homeostasis in mice by a synthetic circuit. Nat. Biotechnol. 28, 355–360 (2010).

6. Ye, H., Baba, M. D. El, Peng, R. W. & Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science 332, 1565– 1568 (2011).

7. Stanley, S. A. et al. Radio-wave heating of iron oxide nanoparticles can regulate plasma glucose in mice. Science 336, 604–608 (2012).

8. Ye, H. et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 141–146 (2013).

9. Rössger, K., Charpin-El-Hamri, G. & Fussenegger, M. A closed-loop synthetic gene circuit for the treatment of diet-induced obesity in mice. Nat. Commun. 4, 1–9 (2013).

10. Rössger, K., Charpin-El-Hamri, G. & Fussenegger, M. Bile acid-controlled transgene expression in mammalian cells and mice. Metab. Eng. 21, 81–90 (2014).

11. Rössger, K., Hamri, G. C. El & Fussenegger, M. Reward-based hypertension control by a synthetic brain-dopamine interface. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 18150–18155 (2013).

12. Nissim, L. & Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Mol. Syst. Biol. 6, 444 (2010).

13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science 333, 1307–1311 (2011).