Proizvodnja škrlatnega indigoidnega barvila iz triptofana v bakteriji Escherichia coli
Škrlat je starodavno barvilo, ki so ga v preteklosti pridobivali iz prekurzorja ekstrahiranega iz mediteranskih morskih polžkov iz družine Muricidae1,2. Glavna komponenta škrlata je 6,6'-dibromoindigo (6BrIG), ki daje snovi značilno vijolično barvo3. Barvilo se uporablja predvsem za barvanje tkanin, zaradi konjugiranih π-vezi pa se danes kaže tudi kot dober polprevodniški material4,5. Za pridobitev 1,4 g škrlata iz naravnih virov je potrebno žrtvovati 12 000 polžev, zato že od nekdaj velja za drago surovino6. Kljub temu da so danes poznani različni postopki kemijske sinteze 6BrIG, njegova proizvodnja še vedno ni izvedljiva v industrijskem merilu, veliko težavo namreč predstavljajo mestnospecifično bromiranje indolnega obroča, nizek izkoristek in visok strošek izhodnega materiala4,7.
Korejski raziskovalci so predstavili alternativno strategijo proizvodnje 6BrIG v bakteriji E. coli. Za vzpostavitev biosintezne poti so uporabili triptofan-6-halogenazo (SttH) iz S. toxytricini, triptofanazo (TnaA) iz E. coli in monooksigenazo (MaFMO) iz M. aminisulfidivorans, ki vsebuje flavin. Ustvarili so dvocelični reakcijski sistem, ki je omogočal nastanek specifičnega produkta - 6BrIG7.
Vzpostavitev poti – od triptofana do 6-bromoindola
Na osnovi predhodne študije8 o biološki sintezi 6BrIG so se raziskovalci odločili, da bodo v prvi stopnji sinteze iz triptofana (Trp) prekomerno proizvedli 6-bromoindol (6-Br-indol). To spojino je z uporabo encimov SttH in TnaA mogoče sintetizirati po dveh poteh. Prva pot poteka preko pretvorbe Trp v indol, čemur sledi bromiranje indola. Druga pot pa se začne z bromiranje Trp in nadaljuje s pretvorbo nastalega intermediata 6-bromotriptofana (6-Br-Trp) v 6-Br-indol. Obe poti so natančno okarakterizirali in vivo. Da bi preprečili vpliv endogene TnaA, so uporabili sev E. coli z delecijo ΔtnA. V primeru da je bilo izražanje TnaA potrebno, pa so izvedli transformacijo celic s plazmidom, ki je nosil zapis za ta encim.
Na podlagi rezultatov so zaključili, da več 6-Br-indola nastane, če v prvi stopnji poteče reakcija s SttH, ki katalizira pretvorbo Trp v 6-Br-Trp, v drugi pa reakcija s TnaA, ki katalizira pretvorbo 6-Br-Trp v 6-Br-indol7.
Konstrukcija fuzijskega encima SttH
Halogenazo SttH so uspešno prekomerno izrazili v bakteriji E. coli, vendar pa se je encim v večini nahajal v netopni obliki, kar bi lahko precej zmanjševalo pretvorbo Trp v 6-Br-Trp. Povečanje aktivnosti SttH so poskušali doseči s povečanjem njene topnosti, in sicer s tvorbo fuzijskega encima. Na N-konec SttH so pripeli flavin reduktazo (Fre), saj se v E. coli visoko izraža v topni obliki, hkrati pa ta encim učinkovito regenerira kofaktor FAD v FADH2, ki ga SttH potrebuje za svoje delovanje. Za stabilnost in bioaktivnost fuzijskega encima so Fre in SttH povezali z rigidnim povezovalcem (Fre-L3-SttH). Rezultati, ki so jih dobili, so pokazali, da je Fre primerna N-končna oznaka, ki učinkovito poveča aktivnost SttH s povečanjem topnosti kot tudi oskrbe s kofaktorjem7.
Proizvodnja škrlatnega barvila v E. coli in barvanje tkanin
Za vzpostavitev reakcije v celicah E. coli ΔtnA, ki iz Trp proizvajajo 6-Br-indol, so zasnovali zaporeden dvocelični reakcijski sistem. V prvem celičnem sistemu se je izražala halogenaza Fre-L3-SttH, ki je Trp pretvorila v 6-Br-Trp, v drugem pa sta se hkrati izražali triptofanaza TnaA, ki je 6-Br-Trp pretvorila v 6-Br-indol, in monooksigenaza MaFMO, ki je katalizirala končno pretvorbo 6-Br-indola v 6BrIG. Z usedlino bakterij, ki so proizvajale škrlat, so nato obarvali tkanine različnega izvora. Ugotovili so, da se bolj učinkovito obarvajo tkanine živalskega izvora, kot sta svila in volna. Poleg tega je učinkovitost barvanja s celično usedlino primerljiva z učinkovitostjo barvanja s kemičnim barvilom7.
Zaključek
S konstruiranjem biosintezne poti v bakteriji E. coli in uporabo zaporednega dvoceličnega sistema za proizvodnjo šklatnega indigoidnega barvila iz Trp so korejski znanstveniki pokazali, da je iz 2,5 mM Trp mogoče proizvesti do 0,75 mM (315 mg/L) 6BrIG. Poleg tega so dokazali, da je mogoče usedlino bakterij E. coli, ki vsebujejo biosintetizirano barvilo, direktno uporabiti za barvanje tkanin. Vsestranskost zaporednih dvoceličnih reakcij in uporabnost ustvarjenega sistema so na koncu dokazali še z uspešno pripravo različnih dihalogeniranih indigov7.
Viri in literatura
1. Wolk, J. L. in Frimer, A. A. Preparation of Tyrian purple (6,6’-dibromoindigo): Past and present. Molecules 15, 5473–5508 (2010).
2. Cooksey, C. Tyrian purple: the first four thousand years. Sci. Prog. 96, 171–186 (2013).
3. McGovern, P. E. in Michel, R. H. Royal Purple Dye: Tracing Chemical Origins of the Industry. Anal. Chem. 57, (1985).
4. Głowacki, E. D. et al. Indigo and Tyrian purple - From ancient natural dyes to modern organic semiconductors. Israel Journal of Chemistry 52, 540–551 (2012).
5. Truger, M. et al. Surface-Induced Phase of Tyrian Purple (6,6′-Dibromoindigo): Thin Film Formation and Stability. Cryst. Growth Des. 16, 3647–3655 (2016).
6. Wolk, J. L. in Frimer, A. A. A simple, safe and efficient synthesis of Tyrian purple (6,6’-Dibromoindigo). Molecules 15, 5561–5580 (2010).
7. Lee, J. et al. Production of Tyrian purple indigoid dye from tryptophan in Escherichia coli. Nat. Chem. Biol. 17, 104–112 (2021).
8. Heine, T., Großmann, C., Hofmann, S. in Tischler, D. Indigoid dyes by group monooxygenases: Mechanism and biocatalysis. Biol. Chem. 400, 939–950 (2019).
