Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: iGEM:SZPT-CHINA

Uvod

Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3]. Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

Cilj projekta Kissed by light

Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline. Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1]. Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

Načrt

Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

Računalniško modeliranje

V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1]. Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model. Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

Uvodni eksperimenti

Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

Proizvodnja pseudomonalnega proteina(BBa_K3740050)

Načrt

Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8]. Protein SE (BBa_K3740057) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 (BBa_K3740034) [1]. Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].

Izvedba

Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1]. Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030])

Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS (http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR (http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

Varnost in sproščanje zdravila (BBa_K3740044)

V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1]. Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9]. Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1]. Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].

Izboljšave

Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1]. Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

Končni produkt

Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

Viri

[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022]. [2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022]. [3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2. [4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A. [5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4. [6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X. [7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07. [8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203. [9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.