Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

Uvod

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s trans regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. Trans regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske

Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo trans. Pri Arabidopsis thaliana se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s Pseudomonas syringae (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo trans

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

TE kot vir novih smRNA

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske

TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste Arabidopsis transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri Arabidopsis je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri Arabidopsis se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma Arabidopsis. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

Zaključek

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

Viri in literatura

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. Journal of Experimental Botany, edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. The Plant Journal, vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. Frontiers in Plant Science, vol. 9, May 2018, p. 600. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ELife, edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. eLife, https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” PLoS Genetics, edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.