Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo
Uvod
V današnjem svetu v znanosti prihaja do znatnih napredkov na področju urejanja genoma ter na področju integracije informatike v samo raziskovalno delo. Področje biološkega inženirstva tako na podlagi novih in cenejših tehnik odpira vrata mnogim novim produktom na področju ved o življenju. Razvoj pa je trenutno nekoliko omejen z obdelavo podatkov, ki nastajajo med samimi inženirskimi procesi. Tekom enega samega projekta nove podatke predstavljajo laboratorijski dnevniki, protokoli, preglednice, uporabljeni sevi in njihove modifikacije, uporabljeni oligonukleotidi itd., kar vodi v nastanek terabajtov novih podatkov. Ob zaključku nekega projekta ali raziskave je javnosti predstavljen le končni produkt z omejenim naborom podatkov, ki so predstavljeni v člankih. Zaradi omejene dostopnosti podatkov lahko v prihodnosti prihaja do težav s ponovljivostjo rezultatov, večkrat pa se je tudi že zgodilo, da so bile naknadno morda odkrite kakšne napake, ki so potem vodile do umika znanstvenih člankov. Taki incidenti so neželeni s strani znanstvenih revij in znanstvenikov, hkrati pa se ob takih dogodkih zamaje tudi zaupanje javnosti v znanstvene raziskave.
Tellecha-Luzardo in sodelavci so k temu problemu pristopili z razvojem sistema za nadzor različic (ang. version control system). Novo razviti sistem so poimenovali CellRepo. Sistem obstaja v oblaku in združuje nadzor različic za sledenje podatkov o uporabljenih organizmih ter protokole za uvedbo črtnih kod v bioloških podatkih. Na ta način so biološki vzorci povezani z digitalnimi podatki, ki so shranjeni v oblaku, njihova dostopnost pa je določena s strani uporabnika [1].
Sistemi za nadzor različic
Ustaljena praksa na področju razvoja nove programske opreme. Gre za programsko opremo za sledenje vsake novo ustvarjene spremembe kode (ang. commit), ki jo posamezni programerji napravijo na svojem računalniku. Vsaka sprememba predstavlja stanje datotek ob določenem času, skupaj z avtorjem, opisom in podatkih o predhodnih spremembah. Predstavlja osnovno enoto nadzora različic. Vse zabeležene spremembe se hranijo v repozitoriju. Poleg tega sistem za nadzor različic lahko omogoča tudi sodelovanje programerjev iz različnih koncev sveta. Celotna skupina lahko dostopa in ureja izvorno kodo. Skupna koda se tako posodablja, brez da bi posamezniki ločeno shranjevali in urejali svoje verzije kode, kar bi lahko vodilo do ponavljanja kode ali do izbrisa določenih segmentov. Sistem omogoča tudi sledljivost, saj beleži kdo in kdaj je napravil kakšno spremembo [2, 3].
Črtne kode DNA
Črtna koda DNA je krajše nukleotidno zaporedje v genomu, ki je unikatno za določeno vrsto ali sev organizma. Črtne kode se uporabljajo predvsem v taksonomiji kot pomoč pri identifikaciji in klasifikaciji organizmov. Iz organizma najprej izolirajo DNA, s PCR pomnožijo regijo črtne kode, vstavijo v vektor ter ji nato določijo nukleotidno zaporedje. Dobljeno zaporedje nato vnesejo v bazo podatkov in določijo vrsto organizma, kateri pripada izolirana koda [4, 5].
Uporaba črtnih kod DNA v sintezni biologiji omogoča označevanje šasij, kar pripomore k sledljivosti. Hkrati svoje mesto najdejo tudi pri identifikaciji gensko spremenjenih organizmov, ki se znajdejo izven laboratorijev. V primeru, da pride do neželene kontaminacije okolja s sevom, ki je označen s črtno kodo, lahko sev hitro identificirajo ter dostopajo do z njim povezane dokumentacije o stopnji tveganja [1].
Rezultati
CellRepo
Novo postavljen sistem za nadzor različic, ki je zgrajen na osnovi moderne programske opreme za spletne aplikacije. Namenjen je sledenju in organizaciji digitalnih podatkov, ki nastajajo med biološkim inženiringom ter povezovanju teh podatkov z biološkimi vzorci. V osnovi ima CellRepo dve ključni funkciji:
1. Zbiranje podatkov o sevih tekom eksperimentov oziroma projektov: Med inženirskim procesom lahko sodelujoči vpisujejo podatke o genotipu, fenotipu, avtorjih, protokolih, rezultatih kot spremembe. Ob trenutku pomembnejših sprememb se lahko generira črtna koda DNA, s katero se označi izbrani sev
2. Povezovanje vzorcev s spremembami prek črtnih kod DNA: Z identifikacijo črtne kode DNA v sevu lahko s CellRepo dobijo vpogled v trenutek, ko je črtna koda DNA nastala. S tem dobijo tudi vse pripadajoče informacije o identificiranem sevu.
CellRepo je namenjen tako individualni rabi kot uporabi znotraj neke večje skupine raziskovalcev. Uporabnik se mora najprej registrirati in navesti nekaj osebnih podatkov. Ob registraciji se uporabniku odpre domača stran, ki vsebuje vse kar uporabnik potrebuje za gradnjo repozitorija sevov, na katerih poteka njegovo eksperimentalno delo. Svoj repozitorij lahko deli s svojo raziskovalno skupino ali s splošno javnostjo. To torej pomeni, da uporabnik lahko dostopa tudi do določenih drugih repozitorijev v katerih ni vključen, vendar so javno dostopni. S tem želijo znanost narediti bolj transparentno in dostopno tudi za javnost [1].
Ko uporabnik želi ustvariti nov repozitorij, mora najprej izbrati vrsto uporabljenega organizma. Tako lahko začne z vnosom sprememb v osnovni veji repozitorija. V primeru različnih dodatnih eksperimentov znotraj izvornega projekta lahko uporabnik repozitorij razveja v več vej ali podskupin. Uporabniki z dostopom do repozitorija lahko vanj vnašajo spremembe s katerimi označijo sev ob določenem času. Obsežnost vnešene spremembe je prepuščena uporabnikom – lahko vnašajo nukleotidna zaporedja, slike gelov po elektroforezi, rezultate bioinformatskih analiz ali protokole, ki so jih uporabili pri delu. CellRepo uporabnikom omogoča tudi, da določene spremembe zabeležijo kot prelomne. V takih primerih sam sistem lahko generira črtno kodo DNA, katera se potem lahko sintetizira in vstavi v genom seva. S tem je sev nedvoumno označen, črtna koda DNA pa omogoča povezavo do spremembe, pri kateri je koda nastala [1].
Za demonstracijo uporabe CellRepo so Tellecha-Luzardo in sodelavci pokazali kako platforma deluje pri uporabi šestih različnih sevov bakterij in gliv. Uporabili so organizme Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces albidoflavus, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae in Komagataella phaffi [1].
Vnos črtnih kod DNA
Vnos črtnih kod DNA so testirali na vseh šestih izbranih organizmih. Pri vsakem sevu so uporabili do tri različne metode za vnos črtne kode DNA. Po vnosu so preverili še morebiten vpliv vnosa črtnih kod na posamezne organizme. Spremljali so rast in pojavnost mutacij v izbranih organizmih po vnosu črtne kode DNA ob različnih rastnih pogojih. V splošnem so ugotovili, da ima vnos črtne kode DNA zelo malo ali nič vpliva na rast izbranih vrst organizmov. Za določitev stopnje pojavnosti mutacij so sekvencirali celotne genome organizmov po vnosu črtne kode in primerjali z organizmi divjega tipa. Ugotovili so, da je pri vseh organizmih stopnja mutacij po vnosu črtne kode DNA zelo nizka. Identificirali so sicer posamezne točkovne mutacije, ki pa se v več replikah niso ponavljale na istih mestih. Iz teh rezultatov so sklepali, da so bile točkovne mutacije verjetno posledica več rastnih ciklov v različnih gojiščih in ne direktna posledica vnosa črtne kode DNA. Zaradi razlik pojavnosti mutacij med posameznimi metodami vnosa črtne kode DNA, uporabnik lahko ob generaciji črtne kode DNA v CellRepo izbere metodo vnosa črtne kode DNA glede na ocenjeno uspešnost metod pri vsakem sevu [1].
Preverili so tudi stabilnost črtne kode DNA v daljšem časovnem obdobju stacionarne faze rasti. S tem so želeli preveriti stabilnost v pogojih, ki se pojavljajo v laboratorijih ali večjih industrijskih procesih. Po pomnoževanju izbranih regij s PCR in sekvenciranju po Sangerjevi metodi so potrdili prisotnost črtnih kod tudi po daljši inkubaciji pri različnih eksperimentalnih pogojih [1].
Zaključek
Z razvojem programa CellRepo so želeli v znanost o vedah o življenju implementirati načine dela iz sveta programiranja. Z uporabo takih sistemov za nadzor različic bi se lahko povečale sledljivost, ponovljivost, sodelovanje, transparentnost in ekonomičnost v znanosti. Sledljivost bi bila zagotovljena z uporabo črtnih kod DNA. Prek črtnih kod DNA bi lahko dostopali do sprememb zabeleženih v repozitorijih. Ti repozitoriji bi hranili vse podatke v zvezi s posameznimi projekti, kar olajša tudi ponovljivost eksperimentov in sodelovanje znotraj raziskovalnih skupin. Podatki v repozitorijih bi posamezne projekte ali raziskave naredili tudi bolj transparentne, kar bi olajšalo identifikacijo in popravljanje napak ter hkrati pripomoglo k povečanju zaupanja javnosti v znanstveno delo [1].
Literatura
[1] J. Tellechea-luzardo, L. Hobbs, E. Velázquez, S. Woods, V. De Lorenzo, N. Krasnogor: Versioning biological cells for trustworthy cell engineering. str. 1–12.
[2] N. N. Zolkifli, A. Ngah, A. Deraman: ScienceDirect ScienceDirect Version Control System : A Review Version Control System : A Review. Procedia Comput. Sci. 2018, 135, str. 408–415.
[3] Nadzor različic — Uvod v programiranje http://matija.pretnar.info/uvod-v-programiranje/10-nadzor-razlicic.html (pridobljeno 29. 4. 2022).
[4] R. S. Purty, S. Chatterjee: DNA Barcoding : An Effective Technique in Molecular Taxonomy. 2016.
[5] Z. Kowalska, F. Pniewski, A. Latała: Ecohydrology & Hydrobiology DNA barcoding – A new device in phycologist ’ s toolbox. Integr. Med. Res. 2019, 19(3), str. 417–427.
