Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: [1]

PROBLEM

Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva. Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi. Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

IDEJA

Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593. Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

NAČRT

Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

MODEL

Sinteza dsRNA

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

Dostava in sprostitev dsRNA

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih. Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing (QS), kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

Sistem utišanja tarčnih genov

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

EKSPERIMENT

Sinteza dsRNA

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov. Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1,3].

Dostava in sprostitev dsRNA

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

Sistem utišanja tarčnih genov

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

UPORABNIKI

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč. Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

VIRI

[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:Ecuador (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] Richard W Carthew and Erik J Sontheimer. Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell, 136(4):642–655, 2009.

[3] V. Gurdaswani, S. B. Ghag, y T. R. Ganapathi, “FocSge1 in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 is essential for full virulence”, BMC Microbiology, vol. 20, núm. 1, p. 255, ago. 2020, doi: 10.1186/s12866-020-01936-y