Dvosmerni
Uvod
Yarrowia lipolytica je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji1. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom Y. lipolytica. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
Katabolizem eritritola
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4]. Katabolizem eritritola v Y. lipolytica se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen EYD1. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen EYK1. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom EYL2), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen EXL1, in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen EUF1 kodira za transkripcijski faktor, pri sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza. Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z EYK1 in EYD1. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za EYK1 in tudi za EYL1. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato se ne morejo uporabiti v industrijski rabi. V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v Y. lipolytica. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)).
Rezultati
Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in EUF1, EYK1 in EYL1, ter EYD1 in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov Y. lipolytica. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med EYK1 in EYKL1 dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo. Intergenska regija med EYK1 in EYL1 je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu EYK1 start kodona. Primerjali so intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu Yarrowia. Našli so še drugo škatlo TATA blizu EYK1 start kodona. Regija med EYK1 in EYL1 je eritritol-inducibilen BDP Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja. Uporabili so 6 biokock in vektor. Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali YFP-TLIP2, RedStarII-TLIP2, in intergensko regijo EYK1-EYL1 (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti EYK1 in protismerno orientacijo proti EYL1. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP (JME4766) in GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP (JME4891) in GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP (JME4892). Plazmide, ki so vsebovali BDP divjega tipa, so vstavili v Y. lipolytica. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh. Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco v obeh transkripcijskih orientacijah. Transkripcija v smeri EYL1 je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti EYK1. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.
Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. Y. lipolytica so naredili delecijo EYK1, da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri Y. lipolytica niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču. Hibridni pEYK450 Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s 5 škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (pEYK450-5AB-Fw in pEYK450-5AB-Rv). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri EYL1 je bila 2-krat večja kot v smeri EYK1, kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri EYK1 in 10,8 – krat večjo moč v smeri EYL1. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije. Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat. Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.
