Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

Povzeto po članku: S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

Uvod

Ekspresija proteinov obsega več korakov in zahteva poznavanje več sistemov. Da učinkovito izražamo proteine v bakterijskih celicah moramo razumeti potek transkripcije in translacije. Za razliko od različnih možnosti uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijskem in translacijskem nivoju, je na regulacijo števila kopij plazmidov v celici težje vplivati. Vsak plazmid ima fiksno število kopij v bakterijski celici, na katerega navadno ne moremo vplivati. Da bi našli pravo število kopij plazmida v celici, ki je potrebno za ekspresijo proteina, moramo za vsak eksperiment naš konstrukt klonirati v vektorje z različnimi števili kopij v celici in te vektorje transformirati v bakterijske celice. Pri tem dolgotrajnem delu pogosto pride do napak, zato so razvili sistem Tulip (TUnable Ligand Inducible Plasmid), ki omogoča enostavno in učinkovito spreminjanje števila kopij plazmida v celici [1, 2].

Razvoj Tulipa

Plazmid pSC101

Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].

Mutacije v proteinu repA

Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].

V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

Optimizacija Tulipa

Za lažjo uporabo so se odločili združiti celoten sistem na en sam konstrukt. Pod promotor PCymRC so vključili zapisa za proteina repAv7 in cymRAM. Ob dodatku kuminske kisline se cymRAM ni več mogel vezati na promotor, torej je potekala transkripcija genov za repAv7 in cymRAM. Zaradi povišanje koncentracije repAv7 je prišlo do višanja števila kopij plazmida v celici. Ko je količina sintetiziranega cymRAM presegla raven kuminske kisline v celici, se je cymRAM zopet vezal na promotor PCymRC, do transkripcije ni prišlo, število kopij plazmida v celici pa se je ustalilo. Spreminjanje koncentracije kuminske kisline v rastnem mediju celic je učinkovito delovalo na spreminjanje števila kopij plazmida v bakterijskih celicah [1].

Spreminjanje RBS in dodajanje degradacijske oznake

Sistem Tulip so dodatno izboljšali z optimizacijo ribosom vezavnih mest pred zapisoma za repAv7 in cymRAM. Naredili so plazmidne knjižnice z različnimi RBS, ki so jih transformirali v bakterijske celice, s pretočno citometrijo pa so merili fluorescenco konstitutivno izraženega sfGFP. Pri nizkih koncentracijah kuminske kisline je pogosto prišlo do prevelikega števila kopij plazmida v celici, kar so pripisali prepočasni razgradnji repAv7. Problem so rešili tako, da so zapisu za repAv7 dodali zapis za degradacijsko oznako. Degradacijska oznaka poveča hitrost razgradnje proteina tako, da omogoči lažjo vezavo na proteaze, ki so odgovorne za razgradnjo drugih endogenih proteinov v celici. Preizkušali so delovanje dveh degradacijskih oznak (AAV in AVS), kot boljša se je izkazala oznaka AAV [1, 5].

Karakterizacija Tulipa

Sistem Tulip so vključili v vektor in ga transformirali v bakterije seva NEBStable. Sev NEBStable je posebej primeren za transformacijo in pomnoževanje plazmidov. Na njem so okarakterizirali delovanje Tulipa tako, da so merili fluorescenco sfGFP v odvisnosti od koncentracije kuminske kisline. S PCR v realnem času so ugotovili, da lahko spreminjamo vrednost števila kopij plazmida med 2,9 in 50,9. Fluorescenca GFP je bila sorazmerna dodani kuminski kislini in številu kopij plazmida. Preverjali so tudi rast bakterijskih celic in ugotovili, da sistem Tulip ne predstavlja dodatnega bremena celicam, rast celic je bila primerljiva pri različnih koncentracijah kuminske kisline [1].

Lastnosti Tulipa

Obstojnost v drugih bakterijskih sevih

Učinkovitost Tulipa so preverili tudi v drugih pogosto uporabljenih bakterijskih sevih: DH10B (klonirni sev), NEBExpress (modificiran ekspresijski sev), BW25113 in MG1655 (modelni sev). Vse seve so transformirali s sistemom Tulip s konstitutivno izraženim zapisom za sfGFP. Vsi sevi razen seva NEBExpress so imeli število kopij plazmida sorazmerno s koncentracijo kuminske kisline, dodane gojišču. Sev NEBExpress je imel izmerjeno višjo fluorescenco sfGFP in višje število kopij plazmida že pri nizki koncentraciji kuminske kisline. Sev NEBExpress ima okvarjenih več proteinov, ki so odgovorni za razgradnjo drugih proteinov v celici, zato je v njem prišlo do kopičenja repAv7 in do sorazmernega povečanja števila kopij plazmida in fluorescence [1].

Regulacija Tulipa

Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].

Uporaba Tulipa

Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].

Zaključek

Za izražanje proteinov je poleg učinkovitega promotorja pomembno tudi število kopij plazmida v celicah, kar omogoča sistem Tulip. Omogoča dinamično regulacijo števila kopij plazmida v celici skozi čas, je obstojen v celicah, uporaben v več bakterijskih sevih in ne povzroča dodatnega bremena celicam. Prava prednost Tulipa leži v krajšem času, ki je potreben za izbiro pravega števila kopij plazmida. Namesto, da vključke kloniramo v vektorje z različnimi števili kopij na celico in vsak vektor posebej transformiramo v celice, lahko v celice vključimo sistem Tulip in s spreminjanjem koncentracije kuminske kisline izberemo pravo število kopij plazmida, s čimer prihranimo na času in denarju.

Literatura

[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.

[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.

[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.

[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.