S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

Povzeto po članku: [Jiang, H.-K., Ambrose, N. L., Chung, C. Z., Wang, Y.-S., Söll, D., & Tharp, J. M. (2023). Split aminoacyl-tRNA synthetases for proximity-induced stop codon suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences, 120(8), e2219758120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219758120]

Uvod

Razcepljena ortogonalna aminoacil-tRNA sintetaza (o-aaRS) je bila dizajnirana in ustvarjena za kontrolo translacije v bakterijskih (E. coli) in sesalskih celicah (HEK23). Njihova vloga je supresija stop kodonov v prisotnosti majhnih molekul rapamicina in abscisne kisline, kar je omogočeno preko kemično inducirane dimerizacije. V odsotnosti o-aaRS je stop kodon supresija izključena, torej je translacija inhibirana. V članku so uporabili takšno o-aaRS, ki prepozna nekanonične oz. nenaravne aminokisline [2] kot substrat. Če dodamo ncAA in o-aaRS, potem bo aminoacil-tRNA sintetaza vezala ncAA na supresorsko tRNA in to bo omogočilo translacijo tarčnega gena. V članku so uporabili pirolizil-tRNA sintetazo (PylRS) in tirozil-tRNA sintetazo [1].

Načrtovanje in validacija split tRNA sintetaz

Pirolizil-tRNA sintetaza (PylRS)

Za sintezo razcepljene o-aaRS na podlagi PylRS so uporabili PyRS iz arheona Ca. Methanomethylophilus alvus, ki je prepoznala nekanonično aminokislino meta-iodo-L-fenilalanin (mIF) kot substrat. S pomočjo kristalne strukture so določili 7 potencialnih cepitvenih mest, ki so dala N (PylRSN) in C (PylRSC) fragment. Naredili so fuzijo s peptidoma SYNZIP17 (N fragment) in SYNZIP18 (C fragment). Za preverjanje aktivnosti razpolovljene PylRS so fuzijske SYNZIP fragmente soizražali s pirolizin tRNA (tRNAPyl) in zelenim fluorescenčnim proteinom, ki je znotraj odprtega bralnega okvirja vseboval stop kodon TAG na poziciji 2 (sfGFP-2TAG). SfGFP (superfolder GFP [3]) produkcija je pričakovana samo takrat, ko lahko razpolovljena PylRS aminoacilira tRNAPyl z nekanonično aminokislino mIF. SfGFP fluorescenco so merili posledično tako, da so celice gojili v prisotnosti in odsotnosti mIF. Rezultati so pokazali, da je bila produkcija sfGFP v celicah, ki so rastle v prisotnosti mIF drastično večjo od celic, kjer ni bilo dodanih ncAA. To so opazili pri petih od sedmih razpolovljenih variant PylRS – Q23, D112, D137, R137, D195. Najaktivnejši razpolovljeni PylRS varianti sta bili tisti, kjer smo razcepili encim na mestih Q23in D137. Pri variantah Q23 in D137 so ugotovili, da je fluorescenca največja pri celicah, ki izražajo fuzijske proteine iz PylRS in SYNZIP peptidov. Nobene fluorescence niso zaznali, če sta bila oba peptida SYNZIP deletirana. Za potrditev teh rezultatov so naredili naslednji eksperiment v E. coli. Ta je simultano izražala SYNZIP-fuzijske PylRS fragmente skupaj z reporterskim genom CmR-112TAG. Celice so nato rastle na mediju z mIF in različnimi koncentracijami kloramfenikola. Celice, ki so izražale PylRS varianto Q23 so lahko rastle na kloramfenikolu z samo N fragmentom (fuzija s SYNZIP peptidom), medtem ko so celice z varianto D137 rastle samo v prisotnosti obeh fragmentov [1].

Tirozil-tRNA sintetaza (TyrRS)

Raziskovalci so uporabili tirozil-tRNA iz Methanocaldococcus jannaschii (MjTyrRS). Določili so 5 potencialnih mest, kjer so lahko cepili encim, da so dobili N (TyrRSN) in C (TyrRSC) terminalni fragment. Naredili so fuzijski protein s SYNZIP17 in SYNZIP18 peptidom. Za ncAA substrat so uporabili para-iodo-L-fenilalaninom (pIF). Aktivnost encima so preverjali s sfGFP, ki je izrazito povečana pri celicah, katerim so dodali pIF. Za normalno delovanje TyrRS so morale celice izražati tako N kot tudi C terminalni fragment. Najaktivnejši varianti MjTyrRS sta bili tisti, ki sta bili cepljeni na mestih K99 in N268. Za potrditev, da je aktivnost razcepljenega encima odvisna od interakcije peptidov SYNZIP, so merili aktivnost MjTyrRS z in brez fuzije s SYNZIP. Za varianto K99 nista bila ne SYNZIP17 ne SYNZIP18 potrebna za normalno aktivnost. Pri N268 varianti pa je bila sfGFP produkcija opazna samo tam, kjer sta bila tako TyrRSN kot tudi TyrRSC fuzijsko povezana s SYNZIP. To je pomenilo, da je interakcija SYNZIP ključna za vzpostavitev aktivnosti MjTyrRS [1].

Detekcija terapevtsko relevantnih PPI-jev z razcepljeno PylRS

Cilj je bil detekcija PPI-jev med pomembnimi terapevtskimi tarčami v bakterijah in človeških celicah. Ker MjTyrRS ni ortogonalna v evkariontih, so se osredotočili na razcepljeno PylRS [1].

APOPTOZA

V tem članku so se raziskovalci odločili, da bodo poskusili detektirati interakcije med BH3 domeno proapoptotičnega proteina tBID in antipoptotičnimi proteini Mcl-1 in Bcl-2 (vežeta na tBID in preprečita apoptozo). Klonirali so PylRSN kot fuzijo z Mcl-1 ali Bcl-2 ter PylRSc kot fuzijo z BH3 domeno (tBID) ali z kontrolnim peptidom (Dead BID). Te fuzijske proteine so nato izrazili skupaj z tRNAPyl in sfGFP-2TAG reporterjem. Nato so merili sfGFP fluorescenco z in brez mIF. Rezultati so pokazali, da nastaja sfGFP, če se izražajo fuzijski protein tBID-PylRSC in Mcl-1 ali Bcl-2. Fluorescenco so zaznali samo v primeru, ko so dodali mIF [1].

SARS-COV-2

V članku so želeli detektirati interakcijo med HR1 (heptad repeat 1) in HR2 (heptad repeat 2) motiva spike (S) proteina SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2) virusa. HR1 in HR2 med seboj interagirata in omogočita membransko fuzijo virusa in gostiteljeve membrane. Za detekcijo interakcije HR1 in HR2 s pomočjo PylRS, so v članku dizajnirali 5 helični kompleks (5-HB) sestavljen iz 2 HR2 heliksov in 3 HR1 heliksov z vmesnim linkerjem, ki ima izpostavljeno hidrofobno zanko, kamor se HR2 heliks lahko veže. Ko so se s 5-HB in HR2 spojeni PylRS fragmenti istočasno izrazili in če so dodali tRNAPyl in sfGFP-2TAG, so opazili sfGFP fluorescenco ob prisotnosti mIF. Te niso zaznali, če je manjkal HR2 ali 5-HB del [2].

Uporaba razpolovljenih aaRS in majhnih molekul kot induktorjev za supresijo stop kodonov

Z RAP induciran dimerizacijski sistem

Raziskovalci so N- in C-fragment MjTyrRS spojili s FKBP in FRB proteini, ki so del rapamicin (RAP)-induciranega dimerizacijskega sistema. V tem sistemu receptorja FKBP in FBR tvorita stabilen dimer le v prisotnosti liganda RAP (rapamicina). V celicah E. coli so izrazili sočasno fuzijska proteina TyrRSN-FBR in TyrRSC-FKBP, tRNATyr, sfGFP-2TAG. Nato so spremljali nastanek sfGFP v prisotnosti in odsotnosti RAP in substrata za MjTyrRS pIF. Ko sta bila prisotna tako pIF kot tudi RAP, je bila fluorescenca sfGFP več kot 2x večja kot v celicah, ki smo jim dodali samo RAP oz. samo pIF. Z večanjem koncentracije RAP se je večala fluorescenca [1].

Z ABA induciran dimerizacijski sistem

ABA oz. abscisna kislina je rastlinski hormon, ki povzroči dimerizacijo ABI in PYL proteinov. Naredili so fuzijski protein ABI in PylRSN ter PYL in PylRSC. Reporter je bil sfGFP-2TAG. Močna produkcija sfGFP je bila v celicah, ki so rastle v mediju z ABA in mIF (substrat PylRS). Tako so sklepali, da lahko ABA učinkovito aktivira PylRS in tako inducira stop kodon supresijo. Sledil je eksperiment v E. coli, kjer so izrazili sočasno ABI- in PYL-PylRS fuzijske proteine, tRNAPyl in CmR-112TAG reporterski gen. Celice so rastle samo tam, kjer je ABA bila dodana. Takšne razpolovljene o-aaRS lahko služijo kot AND vrata, kjer imamo dva inputa (RAP in pIF ali ABA in mIF), da dobimo željen output (read-through čez stop kodon) [1].

Kontrola genskega izražanja v sesalskih celicah

Najprej so želeli optimizirati aktivnost PylRS v ABA-induciranem sistemu tako, da so optimizirali linkerje med PylRS fragmenti in ABI/PYL proteini. Naredili so 7 fuzijskih proteinov, kjer so bili PylRS fragmenti povezani z ABI in PYL preko fleksibilnega linkerja v obliki G(GSG)nG. N je bil od 0 do 6. Aktivnost PylRS so preverili s sfGFP fluorescenco. Ugotovili so, da je daljši linker omogočil večjo aktivnost PylRS in s tem večjo fluorescenco, vendar pa je z daljšim linkerjem postala PylRS bolj nespecifična, torej do stop kodon supresije je prišlo tudi takrat, ko ni bilo dodanih ncAA. Raziskovalci so na podlagi tega izbrali linker n=4 kot optimizirano varianto [1].

Optimizirano varianto so uporabili v HEK293 celicah za predstavitev ABA-inducirane stop kodon supresije. Naredili so fuzijski konstrukt iz PylRSN-ABI in PYL-PylRSC fragmenta, ki so ju povezali s T2A peptidom. Fuzijski gen so izrazili skupaj z tRNAPyl in reporterskim genom (SEAP-41TAG). HEK291 celice so gojili v mediju s PylRS substratom Nε-boc-L-lizin (BocK) in različnimi koncentracijami ABA. Ugotovili so, da se je SEAP aktivnost povečala za več kot 10x, če so celice gojili v mediju, ki je vseboval tako BocK kot tudi ABA kot pa če so celice gojili v mediju, ki je vseboval eno izmed teh dveh stvari. Če ni bilo ABA ali BocK, je bila SEAP ekspresija podobna intenziteti ozadja. Split PylRS deluje kot AND vrata za sesalske celice, saj imamo dva inputa (ABA in BocK), ki generirata en output (stop kodon supresija) [1].

Viri

[1]

[2]

[3]