Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk

Izhodiščni članek: Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk

Uvod

Mikrobni konzorcij (angl. microbial consortium) je definiran kot skupina raznolikih mikroorganizmov, ki lahko sodelujejo kot skupnost [1]. Te skupnosti imajo veliko uporabnost v industrijskih procesih, saj imajo v primerjavi s posameznimi populacijami mikrobov velikokrat izboljšano zmogljivost in robustnost delovanja. Velika genetska vezja namreč predstavljajo veliko breme, ki se ga lahko rešimo, če ustvarimo mikrobno skupnost tako, da kompleksne naloge porazdelimo med več populacij [2,3].

Kljub veliki uporabnosti tega pristopa pa zaenkrat ne obstaja veliko orodij za ustvarjanje ko-kultur industrijsko pomembne kvasovke Saccharomyces cerevisiae. V nadalje predstavljeni raziskavi so Peng in sodelavci pripravili avksotrofne seve in seve s prekomerno ekspresijo, ki se jih lahko uporabi za ustvarjanje ko-kultur na osnovi sintrofije. To je kooperativna strategija interakcij med mikrobi, pri kateri le-ti preživijo z uporabo metabolnih proizvodov, ki jih proizvajajo sosednji mikrobi, čemur lahko rečemo tudi navzkrižno hranjenje (angl. cross-feeding) [2].

Identifikacija ključnih vplivov na dinamiko mikrobnih ko-kultur

Med eksperimentalne strategije, ki jih lahko uporabimo za manipulacijo dinamike mikrobnih ko-kultur, spadajo začetno razmerje populacij, različne stopnje rasti sevov, dopolnjevanje kulture in izmenjava metabolitov. Njihove vplive so okarakterizirali s pomočjo modela, ki prikazuje časovno evolucijo mikrobne populacije in okolja, ki ga sestavljajo glukoza in izmenjani metaboliti. V tem modelu vsak sev i iz okolja privzema glukozo in svoj metabolit j, za katerega je avksotrofen, obenem pa proizvaja metabolit i, za katerega je avksotrofen sev j. Gledali so občutljivost različnih parametrov, in sicer velikost končne skupne populacije in njeno sestavo, čas gojenja kulture, stopnjo rasti vsakega seva ter privzem metabolitov in njihovo proizvodnjo [2].

Analiza dvočlanskih ko-kultur je pokazala, da je velikost končne populacije najbolj občutljiva na različne parametre izmenjave metabolitov, a praktično neobčutljiva na dopolnjevanje metabolitov in spreminjanje razmerja začetnih populacij. Čas gojenja kulture je odvisen predvsem od parametrov akumulacije glukoze, ki jim eksperimentalno ne moremo slediti, in pa od izmenjave metabolitov. Sestava končne populacije je občutljiva na razmerje začetnih populacij in izmenjavo metabolitov. Stopnja rasti posameznega seva je odvisna predvsem od stopnje privzema glukoze, poleg tega pa nanjo vpliva tudi razmerje začetnih populacij, stopnja privzema glukoze drugega seva v ko-kulturi in stopnja proizvodnje metabolita. Ta analiza je pokazala, da bi bilo spreminjanje začetnega razmerja populacij in izmenjave metabolitov dovolj za kontroliranje dinamike ko-kulture [2].

Izdelava nabora sevov za ustvarjanje sintetičnih ko-kultur

S pomočjo manipulacije proizvodnje in izmenjave esencialnih metabolitov med sevom, ki je bil avksotrofen in tistim, ki je imel prekomerno proizvodnjo določenega metabolita, so ustvarili mikrobne skupnosti z določeno dinamiko rasti. Za ta namen so spreminjali sev S. Cerevisiae BY4741, ki ima v osnovi štiri avksotrofne markerje, in sicer gene His3, Leu2, Met15 in Ura3. Izbrali so ga, ker ga z uporabo ustreznih episomalnih genetskih elementov lahko spremenimo v prototrofni sev. Za spremljanje novonastalih populacij pa so uporabili tri fluorescenčne proteine – sfGFP (zelena fluoresenca), mTagBFP2 (modra fluorescenca) in mScarlet-I (rdeča fluorescenca) [2].

Tako so ustvarili 'donorske' in 'prejemniške' fenotipe za ustvarjanje skupnosti kvasovk po meri. Izbrali so si 15 genov, ki so pomembni za sintezne poti različnih aminokislin in nukleotidov in bi jih lahko uporabili za prekomerno proizvodnjo odgovarjujočih metabolitov. Z manipulacijo teh genov so potem ustvarili seve s prekomernim izražanjem in njihove avksotrofne pare [2].

Z merjenjem optične gostote OD₇₀₀ ko-kultur različnih parov so na osnovi rasti določili, kateri od izbranih metabolitov olajša rast v navzkrižno-hranjenih ko-kulturah. Pri 7 metabolitih so ugotovili, da res omogočajo boljšo rast. To so bili adenin in aminokisline His, Lys, Phe, Tyr, Trp in Thr. S pomočjo tekočinske kromatografije-masne spektroskopije (LC-MS) so potrdili, da je bila povečana proizvodnja metabolitov res posledica prekomernega izražanja genov, ki so z njimi povezani [2].

S tem so ustvarili nabor, ki vsebuje 3 fluorescenčne proteine, 15 avksotrofij in 15 izmenjanih metabolitov. Z raziskovanjem njihovih kombinacij se ta nabor lahko uporabi za razvoj novih navzkrižno-hranjenih ko-kultur [2].

Dizajn sintetičnih ko-kultur s dvema in tremi člani

S pomočjo ustvarjenega nabora so nato naredili dodatne sintrofične ko-kulture, kjer so združili dva ali tri različne seve. Najprej so naredili različne kombinacije ko-kultur parov z Lys in ostalimi 5 zgoraj omenjenimi aminokislinami. Vse te ko-kulture so v primerjavi s kontrolnimi monokulturami kazale boljšo celično rast. Na osnovi teh dvočlanskih kultur pa so ustvarili še tročlanske ko-kulture, pri čemer so imele le-te enosmerno ali dvosmerno komunikacijo. Pri enosmerni komunikaciji je vsak član avksotrofen le za en izmenjan metabolit in izraža prekomerno proizvodnjo le enega izmenjanega metabolita, pri dvosmerni komunikaciji pa je vsak član avksotrofen za 2 metabolita in izraža prekomerno proizvodnjo enega. Pri dveh ko-kulturah so opazili bistveno večjo rast v primerjavi z monokulturnimi in dvočlanskimi kontrolami. To sta bili kulturi AKW_VI in AKM_VIII. AKW_VI je kultura s tremi člani, kjer ima vsak dve avksotrofiji izmed ade, Lys in Trp. Pri AKM_VIII pa so te avkotrofije povezane z ade, Lys in Met [2].

Strategije kontrole populacije v sintetičnih ko-kulturah

Izmenjava metabolitov je ključna determinanta velikosti populacije in časa rasti kulture. Za uravnavanje moči te izmenjave so okarakterizirali uporabo 5 različnih promotorjev za ekspresijo genov, ki kodirajo encime odgovorne za prekomerno proizvodnjo teh metabolitov. Pri tem so uporabili 5 dvočlanskih ko-kultur – ade-Lys, Leu-Trp, Val-Lys, Trp-Lys in His-Lys. Rezultati so pri kulturi ade-Lys pokazali, da se z naraščanjem moči promotorja gena za prekomerno proizvodnjo adenina (ade4op) povečuje tudi rast kulture ne glede na moč promotorja gena za encim, ki sodeluje v sintezi lizina (Lys21op). Izražanje Lys21op pa je kulturi koristilo le pri uporabi močnih promotorjev. V ko-kulturah ade-Lys so tudi opazili, da je sev, ki je prekomerno izražal Lys in bil avksotrofen za adenin, postal dominanten. Na splošno so pokazali, da bi s spreminjanjem moči promotorjev za encime, ki prispevajo k izmenjavi metabolitov, lahko usmerjali rast ko-kulture in deleže populacij v različnih parih [2].

Vpliv začetnih razmerij populacij na celično rast in končno velikost populacije so preverjali pri 4 dvočlanskih ko-kulturah – ade-Tyr, ade-Phe, ade-Val, ade-Arg. Za te namene so izbrali tri začetna razmerja, in sicer 10:1, 1:1 in 1:10. Pri paru ade-Tyr so opazili dominantnost seva, ki je avksotrofen za adenin, ne glede na začetno razmerje. Pri parih ade-Phe in ade-Val so opazili korelacijo med začetnim razmerjem sevov in rastjo, pri paru ade-Arg pa rasti niso opazili [2].

Za preverjanje vpliva dodajanja metabolitov so vzeli 3 dvočlanske (ade-Lys, His-Lys in Trp-Leu) in 2 tričlanske kulture (AKH_III in AKW_VI) z enosmerno ali dvosmerno komunikacijo. Pri kulturi AKH_III so ob dodatku kateregakoli od metabolitov (adenin, lizin in histidin) opazili povečano rast ustreznega seva v njej. V kulturi AKW_VI pa ob dodatku metabolitov (adenin, lizin, triptofan) ni bilo spremembe rasti. Pri dvosmerni komunikaciji kulture AKW_VI so bistveno spremembo opazili le pri dodatku lizina in triptofana [2].

Primerjali so tudi vpliv začetne optične gostote kultur in ugotovili, da z višjo začetno vrednostjo OD₇₀₀ dosežejo večjo rast ko-kultur. Prisotna je bila tudi razlika v dinamiki rasti vsakega člana pri različnih začetnih vrednostih [2].

Sintetične ko-kulture za izboljšano proizvodnjo resveratrola

Delitev metabolnih poti med seve v ko-kulturi lahko poveča nastajanje produktov zaradi delitve dela med te člane skupnosti. Zato so Peng in sodelavci svoj nabor orodij testirali v kontekstu proizvodnje antioksidanta resveratrola, čigar sintezna pot vsebuje gene FjTAL, At4CL1 in VvVST. Te so razdelili na dva modula, pri čemer je en vseboval FjTAL (modul 1), drugi pa At4CL1 in VvVST (modul 2). Za delo so si izbrali pare ade-Lys, Trp-ade in Trp-Lys, vsak član teh kultur pa je izmenično vseboval enega od omenjenih modulov, zato so na koncu dobili 6 različnih parov. S pomočjo računalniškega modela so ugotovili, da je rast najbolj odvisna od proizvodnje izmenjanega metabolita, ki ga proizvaja sev z modulom 2, produktivnost in izplen pa od proizvodnje metabolita seva z modulom 1. Prav tako sta obe lastnosti odvisni od začetnega razmerja sevov [2].

Kontrolo proizvodnje resveratrola so potem preverili še eksperimentalno s spreminjanjem začetnih razmerij populacij. Imeli so 6 ko-kultur z navzkrižnim hranjenjem in eno brez. Večina ko-kultur je imela višje vrednosti OD₇₀₀ v primerjavi z monokulturno kontrolo, kar nakazuje na to, da delitev sintezne poti med sevi zmanjša metabolno breme [2].

Zaključek

V tej raziskavi so naredili nabor orodij za ustvarjanje ko-kultur kvasovk z navzkrižnim hranjenjem. Različne ko-kulture imajo različne lasnosti (različne hitrosti rasti, populacijska dinamika, končna biomasa), ki se lahko uporabljajo glede na željeno uporabo ko-kulture. Pokazali so tudi štiri enostavne strategije, ki jih je mogoče uporabiti za nadzor rasti, velikosti in sestave mikrobnih skupnosti [2].

Literatura

[1] R. M. Ram, A. Debnath, S. Negi, H. B. Singh: Use of microbial consortia for broad spectrum protection of plant pathogens: regulatory hurdles, present status and future prospects. Biopesticides: Volume 2: Advances in Bio-inoculants 2022, 319–335.

[2] H. Peng, A. P. S. Darlington, E. J. South, H. H. Chen, W. Jiang, R. Ledesma-Amaro: A molecular toolkit of cross-feeding strains for engineering synthetic yeast communities. Nat Microbiol 2024, 9, 848–863.

[3] K. E. Duncker, Z. A. Holmes, L. You: Engineered microbial consortia: strategies and applications. Microbial Cell Factories. BioMed Central Ltd December 1, 2021.