Kriptični plazmidi v človeških prebavilih

Uvod

Plazmidi so pomembna komponenta človeškega črevesnega mikrobioma in močno prispevajo k njegovi diverziteti, vplivajo pa tudi na naše zdravje. Funkcije za katere zapisujejo črevesni mikrobiomskimi plazmidi so večkrat povezane z njihovo velikostjo; manjši plazmidi zapisujejo za bolj sebične funkcije, večji plazmidi pa kodirajo tudi funkcije, ki lahko zmanjšajo metabolno breme njihovega gostitelja.

Kriptični plazmidi

Manj preučevani so plazmidi, ki ne zapisujejo za jasne koristne funkcije njihovim gostiteljem. Takšnim plazmidom pravimo kriptični plazmidi in so običajno majhni, ena celica pa vsebuje več kopij tega plazmida. Čeprav so razširjeni v različnih vrstah bakterij, jih je težko preučevati, zaradi odsotnosti merljivih fenotipskih značilnosti oz. selekcijskih markerjev. Ker ne zagotavljajo jasne ugodnosti gostitelju, vseeno pa gostitelj porablja energijo za njihovo vzdrževanje, jih nekateri opisujejo kot sebične elemente ali genetske parazite. Kljub temu, pa so lahko kriptični plazmidi evolucijsko koristni, ker spodbujajo pozitivno epistazo, torej okrepijo koristne učinke drugega gena oz. interagirajo z drugimi genetskimi elementi na način, ki je koristen za bakterijo. S tem zmanjšajo potrebo celice po večih plazmidih, kateri so za bakterijo energetsko potratni. Poleg pozitivne epistaze, so se kriptični plazmidi ohranili tudi zaradi velike hitrosti in frekvence prenosa med celicami (konjugacije).

Kriptični plazmid pBI143

Eden najbolj razširjenih plazmidov v človeškem črevesju izmed več kot 68.000 okarakteriziranih je kriptični plazmid pBI143. Ta plazmid so prvič identificirali v Bacteroides fragilis kot 2747 baznih parov velik krožen plazmid, ki vsebuje zapisa za samo dva anotirana gena; mobilizacijski protein mobA, ki omogoča horizontalen prenos plazmida med bakterijskimi celicami in replikacijski protein repA, ki vrši replikacijo plazmida.

Razširjenost po svetu

pBI143 je prisoten v 73% človeških črevesnih mikrobiomov po svetu, pretežno pri ljudeh, ki živijo v industrializiranih državah kot sta Japonska (92%) in ZDA (86%), v nasprotju z manj industrializiranimi državami kot sta Madagaskar (0,8%) in Fidži (8,7%). Pri prebivalcih industrializiranih držav je ta plazmid eden najštevilčnejših elementov v črevesnem mikrobiomu; predstavlja namreč kar 0,1-3,5% vseh metagenomskih branj.

Verzije

V človeškem črevesnem mikrobiomu se nahajajo 3 različne verzije plazmida pBI143, ki so si med seboj identične v 95% celotnega nukleotidnega zaporedja, najbolj pa se razlikujejo v repA genu (75-81% podobnost). Te verzije so tudi lokacijsko različno razporejene: v Severni Ameriki in Evropi prevladuje verzija 1, ki je tudi najbolj podobna referenčni sekvenci, v Aziji prevladuje verzija 2, verzija 3 pa je redkejša.

Gostitelji

pBI143 se ne nahaja samo v svojem predvidenem gostitelju Bacteroides fragilis , temveč tudi v najmanj 11 različnih vrstah 3 različnih rodov: Bacteroides, Phocaeicola, in Parabacteroides. Mobilizacija (prenos) tega plazmida je možna tudi med različnimi vrstami bakterij.

Omejenost na človeško črevesje

Čeprav se gostitelji pBI143 (člani rodov Bacteroides, Phocaeicola, in Parabacteroides) nahajajo v vrsti drugih okolij, je sam plazmid skoraj specifičen za človeško črevesje. Pri ljudeh se plazmid na drugih mestih kot v črevesju (koža, ustna votlina, dihalne poti, nos) nahaja le v manjših količinah, razen tega pa ga ne najdemo niti v črevesju večine živali niti v okoljih kot so oceani, prst in rastline. Izjeme so črevesja laboratorijskih podgan in hišnih mačk, kjer je prisotnost plazmida bistveno (do 100x) manjša kot pri človeku, ter s človeškimi fekalijami kontaminirana okolja kot so kanalizacija in bolnišnične površine. Skoraj absolutna ekskluzivnost pBI143 na človeško črevesje predstavlja možnosti za praktične aplikacije kot je zelo občutljiva in točna detekcija človeške fekalne kontaminacije.

Ohranjenost

pBI143 vsebuje dva gena: mobA in repA. Ker nanju deluje močna selekcija, sta oba zelo dobro ohranjena. To ohranjenost genov določamo s kvantifikacijo razlik v zaporedjih več različic plazmida. Primer take kvantifikacije je določanje vrednosti dN/dS. Ta vrednost pomeni razmerje med substitucijami na nesinonimnih in substitucijami sinonimnih mestih. Nesinonimna mesta ali netiha mesta so tista, na katerih substitucija spremeni aminokislinsko zaporedje. Sinonimna ali tiha mesta pa so tista, za katere se domneva, da so nevtralna, saj se s substitucijo aminokislinsko zaporedje ne spremeni. Na podlagi analize treh različic pBI143 so raziskave pokazale, da imata oba gena nizke dN/dS vrednosti (mobA = 0.11, repA = 0.04), torej da je bilo več substitucij takih, ki ne spremenijo aminokislinskega zaporedja. To potrjuje dobro ohranjenost genov.

Monoklonske populacije

Z analizo več metagenomov so ugotovili, da so razlike v zaporedju nukleotidov v pBI143 v metagenomih večinoma prisotne na mestih, v katerih se razlikujejo tudi tri reprezentativne različice plazmida. Mutacije plazmida se torej pojavljajo na enakih mestih.

Raziskave so pokazale, da večina ljudi nosi monoklonske populacije pBI143, kar pomeni, da so pBI143, ki jih nosi posameznik identični. Analiza več vzorcev metagenomov je pokazala, da so populacije pBI143 v večini metagenomov identične eni izmed treh reprezentativnih različic plazmida ali pa so bile variante enega nukleotida (SNV) stalne znotraj ene populacije.

Za razliko od metagenomov posameznikov pa metagenomi kanalizacij niso monoklonski. Te imajo namreč v povprečju 35 variant enega nukleotida, zato jim pravimo poliklonski. Ker je prisotnost več razlik v posameznem nukleotidu sklepamoo, da so v človeškem črevesju lahko prisotne tudi redkejše verzije pBI143.

Monoklonalnost in vertikalni prenos pBI143

Kako posameznik pridobi in ohrani monoklonsko populacijo pBI143?

Več dejavnikov bi lahko razložilo monoklonske populacije pBI143 v črevesnih metagenomih posameznikov.

Prvi dejavnik je nizka izpostavljenost, pri kateri se predvideva, da večina posameznikov v življenju pride v stik le z eno različico pBI143. vendar pa je zaradi razširjenosti tega plazmida ta razlaga malo verjetna.

Drugi dejavnik, ki bi lahko vplival na monoklonalnost populacije plazmida, je vrsta bakterij, ki nosijo plazmid. Plazmid namreč za replikacijo uporablja bakterijski replikacijski aparat, zato bi se lahko neka različica v določenih bakterije lažje podvajala kot v drugih. Vendar pa je raziskava pokazala, da je različica plazmida bolj odvisna od posameznika kot pa od vrste bakterij, v katerih se plazmid nahaja. Ista različica se nahaja tudi v več različnih vrstah bakterij.

Tretja razlaga monoklonalnosti pBI143 predpostavlja, da različica plazmida, ki se prva pojavi, prepreči drugim, da bi se uveljavile znotraj istega črevesja.

Najprej moramo vedeti, kako se plazmid prenese v človeško telo. Populacije mikrobov skupaj z genetskimi elementi (fagi in transpozoni) se z vertikalnim prenosom prenesejo iz matere na otroka. Da bi proučili, ali se na tak način prenese tudi preiskovani plazmid, so raziskali metagenome 154 mater in njihovih otrok (dojenčkov). Ugotovili so, da imata v večini primerov mati in njen otrok identične vzorce variant posameznega nukleotida. Pari pBI143 mater in otrok so imeli torej več skupnih različic plazmida kot pa so imeli skupnega z različicami pBI143 nesorodnih posameznikov.

Predpostavko, da se v črevesju ohrani tista različica pBI143, ki prva vstopi v črevesje, so raziskave do neke mere potrdile. Pri 69% otrok se je ohranila različica, ki so jo pridobili od matere. V nekaterih primerih pa je mati imela in na otroka prenesla dve različici plazmida (21%). Našli pa so tudi primere, ko se prenesena različica plazmida ni niti zamenjala s katero drugo, niti se ni ohranila. V večini torej v populaciji ostane prvotna različica plazmida.

Kako se takšen plazmid sploh lahko ohrani?

Glede na zelo pogosto pojavljanje plazmida pBI143 v človeških prebavilih in minimalno variabilnost znotraj človeške populacije bi pričakovali, da njegova prisotnost bakterijam nekako koristi. Kljub temu raziskave kažejo, da ima prisotnost plazmida rahlo negativen učinek na bakterijskega gostitelja, saj za njegovo vzdrževanje porablja material in energijo, hkrati pa od tega nima konkretnih koristi. Poleg tega je plazmid odvisen od konjugacijske mašinerije ostalih elementov v celici. Kriptični plazmid tako večino časa deluje kot parazit, za njegovo ohranitev pa je pomembno, da se lahko dovolj hitro prenaša med celicami. Posebnost pBI143 pa je, da lahko preklopi v mutualističen odnos z gostiteljsko celico. V nekaj redkih primerih so v črevesnem metagenomu našli plazmide pBI143, ki so poleg genov repA in mobA vsebovali tudi gene, ki predstavljajo prednost za bakterijskega gostitelja (npr. zapis za fosfatazo, histidin kinazo). Plazmid lahko tako začasno pridobi dodatne gene in jih prenaša med bakterijskimi celicami, kar verjetno prispeva k njegovi ohranitvi. K stabilnosti plazmida prispevajo tudi toksin-antitoksin sistemi, ki so jih našli v nekaterih izmed plazmidov, ki vsebujejo dodatne zapise. Toksin-antitoksin sistemi poskrbijo, da po celični delitvi preživijo le hčerinske celice, ki podedujejo plazmid. Toksin-antitoksin sistemi navadno sestojijo iz dveh elementov – stabilnega toksina in nestabilnega antitoksina; ta sta navadno proteina, lahko pa tudi nukleinski kislini. V ugodnih razmerah antitoksin preko različnih mehanizmov preprečuje škodljivo delovanje toksina. V stresnih razmerah ali ob izgubi plazmida pa se antitoksin ne proizvaja oziroma ga razgradijo znotrajcelične proteaze. Mobilni genetski elementi pogosto razvijejo mehanizme, ki omogočajo bolj učinkovito replikacijo in prenos v stresnih razmerah, ko lahko njihova gostiteljska celica odmre. Če anaerobne bakterije, ki jih najdemo v črevesju, izpostavimo kisiku, se poveča število kopij plazmida v posamezni celici.

Kako lahko njegovo obnašanje apliciramo?

Oksidativni stres je prepoznavna značilnost kronične vnetne črevesne bolezni. Oksidativni stres pri teh boleznih pogosto povzroči disregulacija imunskega sistema. Kot bi pričakovali, črevesni metagenom posameznikov s to boleznijo vsebuje več kopij plazmida pBI143 kot metagenom zdravih posameznikov. Plazmid tako potencialno lahko uporabimo za meritev oksidativnega stresa v človeških prebavilih. Pogostost pojavljanja in specifičnost plazmida pBI143 za človeška prebavila pa lahko izkoristimo še na en način, in sicer za detekcijo kontaminacije vodnih vzorcev s človeškimi fekalijami. Standarden postopek detekcije je sicer PCR amplifikacija 16S rRNA genov populacij za človeka značilnih Bacteroides in Lachnospiraceae. V primerjavi s to metodo pa je detekcija pBI143 veliko bolj občutljiva, saj se v vzorcih pojavlja v nekajkrat večjem številu kot prej našteti markerji. S pomočjo qPCR pBI143 lahko kvantificiramo fekalno kontaminacijo v vzorcih, pri katerih je z določitvijo Bacteroides in Lachnospiraceae sploh ne zaznamo. Plazmid pBI143 lahko torej uporabimo kot zelo občutljiv marker za detekcijo onesnaženja s človeškimi fekalijami.

Zaključek

Kljub temu, da je plazmid pBI143 eden najštevilčnejših genetskih elementov v človeškem črevesju in se v nekaterih delih sveta pojavlja pri več kot 90% posameznikov, ga dolgo nismo opazili. Preučevanje lastnosti plazmida izboljšuje naše splošno razumevanje obnašanja mobilnih genetskih elementov, hkrati pa ga lahko apliciramo na različnih področjih. Vključitev analiz plazmidov pri preučevanju človeških prebavil je ključni korak k celostni obravnavi črevesne mikrobiote.

Viri

[1] E. C. Fogarty idr., „A cryptic plasmid is among the most numerous genetic elements in the human gut“, Cell, let. 187, št. 5, str. 1206-1222.e16, feb. 2024, doi: 10.1016/j.cell.2024.01.039.

[2] J. Qiu, Y. Zhai, M. Wei, C. Zheng, in X. Jiao, „Toxin–antitoxin systems: Classification, biological roles, and applications“, Microbiol. Res., let. 264, str. 127159, nov. 2022, doi: 10.1016/j.micres.2022.127159.

[3] S. R. Stockdale in C. Hill, „Incorporating plasmid biology and metagenomics into a holistic model of the human gut microbiome“, Curr. Opin. Microbiol., let. 73, str. 102307, jun. 2023, doi: 10.1016/j.mib.2023.102307.

[4] del Solar, G., Giraldo, R., Ruiz-Echevarrı´a, M.J., Espinosa, M., and Dı´az�Orejas, R. (1998). Replication and Control of Circular Bacterial Plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 434–464.