Methanivore

Uvod

Z naraščanjem števila svetovnega prebivalstva narašča tudi količina odpadkov. Slednji trend je med drugim posledica izboljševanja življenjskega standarda in industrializacije. Trdni komunalni odpadki po tem ko jih zavržemo končajo na odlagališčih. Tam so podvrženi vrsti kemijskih reakcij. Pod aerobnimi pogoji z aerobno respiracijo nastaja ogljikov dioksid. Večina procesov pa poteka pod anaerobnimi pogoji. Posledica kemijskih reakcij je nastajanje odlagališčnega plina [1],[2]. Odlagališčni oziroma deponijski plin je mešanica plinov, ki nastajajo pri razkrajanju odloženih odpadkov. Največji delež predstavljata metan (45-60 %) in ogljikov dioksid (40-55%), ki igrata veliko vlogo pri globalnem segrevanju. Poleg omenjenih pri razgrajanju nastajajo tudi majhne količine amonijaka, sulfitov, ogljikovega monoksida, vodika in hlapnih organskih komponent [3],[4]. Odlagališča predstavljajo skoraj 30 % celotnih emisij metana, ki ima 21-krat večji potencial globalnega segrevanja v primerjavi z ogljikovim dioksidom [4]. Proces nastajanja odlagališčnega plina je razdeljen v pet faz [1]: - Prva faza: hidroliza in aerobna razgradnja (hidrolitični encimi in aerobne bakterije razgradijo organski material, pri čemer nastajajo CO2, voda in toplota) - Druga faza: hidroliza in fermentacija (poteče pretvorba topnih organskih spojin in bioloških makromolekul v alkohole, organske kisline, amonijak, vodik in CO2) - Tretja faza: acidogeneza in acetogeneza (anaerobne bakterije organske kisline pretvarjajo v acetat) - Četrta faza: metanogeneza (določene bakterijske vrste v anaerobnih pogojih iz acetata proizvajajo CH4) - Peta faza: oksidacija (aerobni mikroorganizmi CH4 pretvarjajo v CO2 in vodo)

Cilji

V Kanadi odlagališčni plin, predvsem metan zbirajo v odlagališču, kjer ga usmerjajo v sežigalni sistem. Tam ga pretvorijo v ogljikov dioksid, tega pa izpustijo v ozračje. Da bi zmanjšali količine nastalega metana in njegovih derivatov na odlagališčih odpadkov, so s projektom želeli pripraviti bakterije, ki bi bile sposobne te spojine porabljati [3]. Končni cilj projekta je bila priprava biološke naprave za zajemanje metana na odlagališčih. Projekt so razdelili na dva dela. S prvim so želeli načrtovati strojno opremo za ločevanje metana in ogljikovega dioksida, opremo za pretvarjanje le-tega v metanol in bioreaktor za gojenje bakterijskih celic na veliki skali. Drugi del pa je zajemal pripravo izboljšanih metilotrofnih bakterijskih sevov, ki bi metanol uporabljale kot vir energije [3].

Načrtovanje strojne opreme

Kot omenjeno, polovico odlagališčnega plina sestavlja ogljikov dioksid, medtem ko manjši del (približno 5 %) zmesi predstavlja dušik. Da bi iz zmesi izolirali metan, so želeli s strojno opremo najprej odstraniti CO2 in nato dušik. Za vsako stopnjo so s programsko opremo MATLAB načrtovali membrane in ju modelirali v simulacijski programski opremi Aspen Plus in BioWin [3].

Pri načrtovanju opreme za oksidacijo metana v metanol so upoštevali gre za strogo nadzorovano reakcijo, saj metan običajno popolnoma oksidira v CO2. Nastanek želenega produkta so nameravali doseči s fotokemičnim ali elektrokemičnim postopkom s katalizatorjem. Tudi tega so modelirali s programskima opremama Aspen Plus in BioWin [3]. Za načrtovanje bioreaktorja so upoštevali velikost obrata in velikost samega fermentorja. Oblikovali so ga z isto programsko opremo kot v prejšnjih dveh primerih. Na koncu so s programsko opremo Solidworks pripravili 3D modele komponent celotnega procesa [3].

Priprava izboljšanih bakterijskih sevov

Z drugim delom projekta so se lotili priprave bakterijskega seva, ki preferenčno asimilira metanol napram ostalim virom ogljika kot je glukoza. Za modelni organizem so porabljali genetsko modificiran bakterijski sev E. coli T-B18, ki je sposoben asimilacije metanola preko ribuloza monofosfatne poti in je bil pripravljen prav z namenom uporabe C1 substratov za sintezo aminokislin [3].

Izbran bakterijski sev vključuje plazmid pETM6, ki omogoča učinkovito rast v okolju bogatem s treoninom in kot vir ogljika za svoj metabolizem uporablja metanol. Na plazmidu je zapisana rezistenca na antibiotik ampicilin. Medtem je zapis za rezistenco na kanamicin vstavljen v bakterijski genom [3],[5].

Da bi dodatno izboljšali porabo metanola so optimizirali metabolizem C1 substratov, kot sta format in metanol. Tega so se lotili z izbijanjem (ang. knock-out) s CRISPR-Cas9 in zamenjavo genov. Osredotočili so se na proteine, ki sodelujejo pri biosintezni poti glicina, ciklu RuMP (pot ribuloze monofosfata, preko katere poteka asimilacija C1 substratov) in glikolizi. Osredotočili so se na naslednje tarčne gene [3]: - tpiA (triozafosfat izomeraza) - frdA (komponenta fumarat reduktaznega encimskega kompleksa) - mdh (metanol dehidrogenaza)

Odstranjevanje plazmida iz E. coli T-B18

Za izbijanje genov s CRISPR so morali E. coli T-B18 transformirati z dvema dodatnima plazmidoma (pCas9 in pTargetF). Da celicam prisotnost treh vektorjev hkrati ne bi povzročala metabolnega bremena, so se najprej lotili odstranjevanja plazmida pETM6 iz celic E. coli T-B18. Za slednje so uporabili antibiotik rifampicin, ki inhibira bakterijsko RNA-polimerazo in tako preprečuje podvajanje plazmida. Metoda je učinkovita le v primeru občutljivosti bakterije na antibiotik. Po nanosom izbrane bakterijske kulture na gojišče z rifampicinom, ni zraslo nič kolonij, s čimer so potrdili občutljivost [3].

Bakterijsko kulturo so zatem nanesli na gojišča z različnimi koncentracijami rifampicina. Na plošči z različnimi kolonijami (koncentracija rifampicina je znašala 10 μg/mL) so izbrali 5 kolonij in jih uporabili za PCR na osnovi ene kolonije. Na ta način so potrdili odsotnost plazmida pETM6 [3].

Zamenjava gena mdh v plazmidu pETM6

Gen mdh kodira encim metanol dehidrogenazo, ki sodeluje pri prvi reakciji v ciklu RuMP in katalizira pretvorbo metanola v formaldehid. Zapis izvira iz bakterije Bacillus stearothermophilus. V okviru projekta so identificirali zapis za omenjen encim, ki ima boljše kinetične parametre (6-krat večja vrednost razmerja kcat/Km) in večjo specifičnost. Gre za varianto metanol dehidrogenaze CT4-1. Pripravljena je bila z usmerjeno evolucijo encima pridobljenega iz bakterijske vrste Cupriavidus necator [3],[6].

Zamenjave gena mdh iz B. stearothermophilus z zapisom iz C. necator so se nameravali lotiti z restrikcijo prvotnega zapisa iz plazmida pRTM6, ki bi ji sledila ligacija novega zapisa. A so bili izkoristki ekstrakcije plazmidne DNA prenizki, da bi le-to lahko uporabili za restrikcijo. Eksperiment je bil neuspešen [3].

Izbijanje genov s CRISPR-Cas9

Na podlagi literature so se odločili izbiti gen tpiA, ki kodira encim triozafosfat izomerazo. Tako naj bi spodbudili asimilacijo in presnovo metanola s ciklom RuMP. Z računskimi analizami so napovedali, da bi z izbijanjem tpiA omenjen cikel vključil kar 40 % metanola. Za izbijanje genov s CRISPR-Cas so se poslužili dvo-plazmidnega sistema in uporabili plazmida pCas9 in pTargetF. Prvi je vseboval zapis za protein Cas9. Medtem ko je drugi vključeval zapis za sgRNA (katere izražanje so inducirali z arabinozo), ki je usmerjala protein do tarčne regije v genomu predhodno pripravljenih celic E. coli T-B18 brez pETM6. Izbrano zaporedje sgRNA so v pTargetF vstavili z inverzno reakcijo PCR. Transformacija opisanih plazmidov je vodila do dvojnega preloma genomske DNA s kompleksom Cas9:gRNA. S homologno rekombinacijo so v genom vstavili donorsko DNA, ki ni vsebovala zaporedja tpiA [3]. Učinkovitost izbijanja genov so preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije. Za reakcijo so načrtali začetne oligonukleotide, ki se prilegali 500 bp navzgor in navzdol od gena tpiA. Pri ločevanju z agarozno gelsko elektroforezo so pri dveh kolonijah dobili relativno čiste produkte pri pričakovani velikosti (približno 1 kb) in potrdili tudi uspešno izbijanje gena [3].

Kvantifikacija porabe metanola s HPLC

Da bi ugotovili ali ima pripravljeni genetsko modificirani bakterijski sev (z izbitim genom tpiA) večjo težnjo po uporabi metanola, so izvedli analizo bakterijske kulture s HPLC. Bakterijska kultura je rasla točno 24 ur v gojišču z metanolom. S primerjavo kromatogramov pozitivne kontrole (minimalni medij z 0,1 M metanolom) in vzorca niso opazili nobene razlike v količini metanola. Tudi kultura E. coli T-B18 z izhodiščnim plazmidom pETM6 ni uporabila nič metanola, kljub temu, da gre za metilotrofno bakterijo. Nasprotno sta oba testirana bakterijska seva za metabolizem uporabljala glukozo. To dokazuje, da sev T-B18 že v splošnem preferenčno porablja glukozo [3].

Izboljšanje bakterijskih sevov z adaptivno laboratorijsko evolucijo (ALE)

Da bi pripravljeni bakterijski sev E. coli T-B18 z izbitim genom prilagodili na porabo metanola so se poslužili postopkov ALE. Z njimi bi izboljšali uporabo metanola in zmanjšali uporabo drugih virov ogljika. Želeli so pripraviti sev, ki bi kot vir ogljika uporabljal le metanol. Evolucijski pritisk bi uvedli z visokimi koncentracijami metanola in nizkimi koncentracijami glukoze v mediju. Eksperimentov so se lotili s serijskim presajanjem celic, pri čemer so stopnjevali stresne pogoje [3].

Modeliranje metabolnega inženiringa metilotrofne E. coli

V okviru projekta so se lotili tudi napovedovanja dodajanja genetskih elementov, izbijanja genov in prekomerne ekspresije tarčnih proteinov za povečano porabo metana oziroma metanola. Pri analizi so uporabili orodja za modeliranje in simulacijo. S pomočjo obstoječih algoritmov za analizo metod kot so analiza ravnotežja pretoka, analiza variabilnost pretoka, delecija genov in rekonstrukcija modelov, so napovedali, katere genetske modifikacije bi izboljšale porabo metana [3].

Literatura

[1] B. Purmessur, D. Surroop: Power generation using landfill gas generated from new cell at the existing landfill site. J Environ Chem Eng 2019, 7. [2] D. S. Grégoire, N. A. George, L. A. Hug: Microbial methane cycling in a landfill on a decadal time scale. Nat Commun 2023, 14. [3] iGEM Toronto: Methanivore. [4] F. A. Osra, H. K. Ozcan, J. S. Alzahrani, M. S. Alsoufi: Municipal solid waste characterization and landfill gas generation in kakia landfill, makkah. Sustainability (Switzerland) 2021, 13, 1–13. [5] addgene: T-B18. [6] T. Y. Wu, C. T. Chen, J. T. J. Liu, I. W. Bogorad, R. Damoiseaux, J. C. Liao: Characterization and evolution of an activator-independent methanol dehydrogenase from Cupriavidus necator N-1. Appl Microbiol Biotechnol 2016, 100, 4969–4983.