Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji
Izhodiščni članek: Preventing Multimer Formation in Commonly Used Synthetic Biology Plasmids
Uvod
V sintezni biologiji so plazmidi nepogrešljivo orodje raziskav, saj njihova uporaba omogoča lažje spreminjanje genov v primerjavi z genskim inženiringom. Med njihovim podvojevanjem lahko pride do napak, kar vodi v nastanek ponovitev, imenovanih multimeri. Ti se sčasoma pričnejo kopičiti in to lahko vpliva na različna sintetična vezja, sploh tista, ki vključujejo encime za urejanje DNA.
Vpliv multimernih plazmidov na stabilnost in zanesljivost vezij
Čeprav je sam nastanek multimerov že proučen, še vedno ni povsem jasno, v kolikšni meri se tvorijo pri rutinski uporabi pogostih laboratorijskih sevov in plazmidov, kar večkrat oteži eksperimente. Pri multimernih plazmidih se več enakih kopij DNA poveže skupaj v eno večjo molekulo. Takšni plazmidi vsebujejo več zaporednih, skoraj identičnih ponovitev istega gena. Ko pride do mutacije (naključne spremembe) v eni od teh ponovitev, lahko ostale kopije še vedno ostanejo nespremenjene (t.i. divji tip, gre torej za nemutirano različico). Ker so vse te ponovitve še vedno fizično povezane skupaj v isti molekuli, se mutirana in nemutirana različica dedujeta skupaj. To povzroči spremembo v funkciji celotnega plazmida, ker bo nosil različne verzije istega zaporedja, kar vpliva na to, kako se bo obnašal pod določenimi pogoji, kot npr. pri selekciji z antibiotiki. Sintetična genska vezja pogosto uporabljajo encime za urejanje DNA, recimo rekombinaze, ki režejo na specifičnih mestih. Če gre za multimerni plazmid (več ponovitev na isti molekuli DNA), lahko rekombinaza zareže na različnih mestih, ali znotraj ene od ponovitev, kjer spremeni zaporedje in s tem povzroči dodatno nestabilnost, ali med različnimi ponovitvami, kjer povzroči preureditev oz. izgubo dela plazmida. To povečuje stopnjo nepredvidljivosti v eksperimentih, saj je težko natančno določiti, kakšne spremembe bodo nastale in kakšen bo njihov vpliv na celotno gensko vezje.
Dejavniki, ki vplivajo na nastanek multimerov
Na pogostost nastanka multimerov vplivajo dejavniki, ki so zapisani bodisi na samih plazmidih bodisi na kromosomu. Med najvplivnejšimi je plazmidni replikon, genetski element, ki uravnava hitrost in čas replikacije plazmida. Samo število kopij se lahko giblje od ena do več sto in se lahko kvantificira z metodami, kot je qPCR. Izvor replikacije in z njim povezani regulacijski elementi replikona določajo, ali se plazmidi v hčerinske celice razdelijo naključno (npr. ColE1) ali na reguliran način (npr. plazmidi tipa F). Poleg tega lahko na nastanek multimerov vpliva tudi kromosomsko ozadje bakterijskega seva. Mehanizem ločevanja multimerov med plazmidno replikacijo je odvisen od različnih kromosomskih rekombinaz, zlasti od RecA. Encim RecA popravlja prelome dvoverižne DNA preko homologe rekombinacije. Najprej se veže na enoverižno DNA in se nato spari s homolognim delom dvoverižne. Pri tem sodelujeta tudi protein RecF in pa kompleks RecBCD, ki izpostavi ssDNA in vključuje aktivnost helikaze in eksonukleaze.
Zaznavanje pogostosti plazmidnih multimerov je težaven proces. Velikokrat se je ugotavljal z gelsko elektroforezo, vendar pa je bila interpretacija težavna, saj se je celo pri preverjenih vzorcih enojnih plazmidov na gelu videlo več lis. Linearni, krožni, superzviti in prekinjeni plazmidi namreč potujejo skozi agarozni gel z različnimi hitrostmi. Zaradi večjih velikosti multimeri potujejo počasneje kot monomeri, vendar jih je pri izolacijah potrebno ločiti od drugih oblik plazmidov. Poizkusi razgradnje z restrikcijo, ki se pogosto uporabljajo za preverjanje identitete in sekvence plazmidov, ne omogočajo natančnega določanja celotne dolžine. Po razgradnji multimerov velikokrat nastanejo fragmenti enake dolžine kot pri enojnih plazmidih in zato z gelsko elektroforezo ne moremo potrditi njihove prisotnosti. Težko jih je zaznati tudi s Sangerjevim sekvenciranjem, ki v teoriji zazna različice, ki izhajajo iz napak podvojevanja plazmidov. Take strukturne oblike se lahko pojavijo pri nastanku multimernih plazmidov (več zaporednih kopij plazmida v eni molekuli DNA), a Sangerjeva metoda zazna predvsem prevladujočo sekvenco, zato mora biti tarčna strukturna oblika v vzorcu prisotna v visoki koncentraciji, drugače bo sekvenčni signal prekril prevladujoč "normalen" signal. Poleg tega mora biti začetni oligonukleotid, ki se uporablja pri sekvenciranju, pozicioniran zelo blizu mesta, kjer je nastala ta različica. Novejše metode, kot je sekvenciranje s kratkimi odčitki, lahko sicer zaznajo oblike, ki niso prevladujoče v vzorcu, saj omogočajo globjo pokritost vzorca (veliko število odčitkov iste regije), a ponavljajoča se zaporedja, kot je multimerni plazmid težko razločijo. To pomeni, da če ni dodatnih mutacij, se kratki odčitki ne morejo sestaviti v jasne informacije o zaporednih ponovitvah plazmidne DNA. Šele z razvojem tehnologij sekvenciranja dolgih odčitkov, kot je nanoporno sekvenciranje, se lahko preseže omejitve elektroforeze, Sangerjevega in sekvenciranja kratkih odčitkov. S posekvenciranjem celotnih plazmidov se multimeri neposredno pokažejo v histogramih dolžin in čeprav ima nanoporni pristop visoko stopnjo napake na posamezni odčitek, to ne vpliva na zaznavanje multimerov, ker je predvsem pomembna ocena, ali se dolžine odčitkov združujejo okoli celoštevilskih večkratnikov pričakovane dolžine plazmida.
Nastanek multimerov v sevih, pogosto uporabljenih v sintezni biologiji
V študiji so preučili nastajanje multimernih plazmidov v dveh pogostih sevih E. coli, in sicer v sevu JM109, ki se uporablja za kloniranje, in v sevu divjega tipa MG1655. Preverili so njihov nastanek v štirih pogostih plazmidih, ki temeljijo na BioBrick vektorjih, in to v pColE1 (BioBrick pSB1C3), p15A (BioBrick pSB3A3), pSC101 (BioBrick pSB4A3) in bakterijskemu umetnemu kromosomu (BAC, izpeljanem iz F plazmida). Z uporabo nanopornega sekvenciranja so ugotovili, da se multimeri ne povečujejo z večanjem števila kopij plazmidov v sevu JM109, medtem ko se v večji meri pojavljajo v sevu MG1655, pri čemer delež plazmidov v obliki multimerov narašča z večanjem števila kopij plazmida in s številom prenesenih kultur (z dodatnim pasiranjem bakterij). Nasprotno pa lahko transformacija multimerov v sev JM109 povzroči nastanek čistih sevov, ki ne vsebujejo nobenih posameznih plazmidov. Prav tako so ustvarili sev MG1655 z izbrisanim genom recA (ΔrecA), ker so predpostavili, da bi delecija lahko preprečila nastanek multimerov. Sev naj bi pokazal zelo majhno tvorbo multimerov, podobno kot sev JM109. Želeli so tudi kvantitativno določiti dinamiko nastanka multimerov skozi tipičen »življenjski cikel« uporabe. V ta namen so testirali plazmide v treh točkah: pred transformacijo, po transformaciji in po rasti iz glicerolne zaloge. To je vključevalo pomnoževanje v omenjenih sevih JM109 in MG1655. Da bi upoštevali morebitne razlike, ki pridejo od različnih izvorov replikacij, so uporabili plazmide z različnim številom kopij. Pri bakterijskem umetnem kromosomu BAC (~1 kopija), pri pSC101 (~5 kopij), pri p15A (~10–12 kopij) in pri ColE1 (~500–700 kopij).
Transformacija v sev JM109
Za ugotovitev porazdelitve multimerov so uporabili nanoporno sekvenciranje. Pričeli so z izolacijo enojnih plazmidov. V ta namen so plazmide najprej ločili glede na velikost z elektroforezo in nato iz gela izrezali ustrezne lise. Da bi pridobili zadostno količino so morali izvesti transformacijo v bakterije JM109 in izolirati DNA plazmidov. Ti t.i. izvorni vzorci so predstavljali stanje plazmidov, kot bi jih prejeli iz zunanjega laboratorija. Da bi zares preverili, ali so plazmidi enojni, so jih analizirali z nanopornim sekvenciranjem in ugotovili, da je v njih le do ~0,3 % dimerov. Za določitev stabilnosti enojnih plazmidov v sevu JM109, so po transformaciji za vsakega izbrali po eno kolonijo, ki so jo nato gojili čez noč v prisotnosti ustreznega antibiotika za selekcijo. Uporabili so dva različna, in sicer ampicilin za plazmide z nizkim in srednjim številom kopij in kloramfenikol za BAC in plazmide z visokim številom kopij. Iz transformirane kulture so nato neposredno izolirali plazmidno DNA, ki je predstavljala vzorce po transformaciji. Prav tako so kulturo shranili kot glicerolno zalogo in jo ponovno gojili čez noč. DNA izolirana iz te kulture, (po glicerolu) je predstavljala stanje, ki se običajno uporablja za eksperimente s sevom, ki vsebuje plazmid. Za vzorce »po transformaciji« in »po glicerolu« so ugotovili, da imajo manj kot ~0,6 % celotne DNA v obliki dimerov, višjih multimernih oblik z več kot dvema ponovitvama pa niso opazili.
Transformacija v sev MG1655D
Izvorne vzorce so transformirali še v MG1655D, da bi raziskali dinamiko multimernih plazmidov v sevu divjega tipa. Tako kot pri JM109 so izolirali DNA tako iz začetne po transformaciji kot tudi iz ponovno vzgojene kulture iz glicerolne zaloge. Po transformaciji je bilo v BAC in plazmidih z nizkim številom kopij manj kot ~0,4 % dimerov. Pri p15A je bilo ~2 % dimerov, pri ColE1 pa 20 % dimerov, 1,3 % trimerov in 1,7 % tetramerov, kar se sklada s pričakovanji. V vzorcih po glicerolu se je delež multimernih plazmidov na splošno povečal, pri čemer je delež dimerov narasel na 6 % pri p15A in 25 % pri ColE1. Pri slednjem so opazili celo heksamere, a le v nizki frekvenci. V nadaljevanju so preverili, ali je možno nastajanje multimerov v sevu MG1655 popolnoma preprečiti. Zato so odstranili gen recA, saj je protein RecA, ki v JM109 ni prisoten, nujno potreben za nastanek multimerov. V sevu so potem opazili, da je bil delež dimerov v vseh pogojih manjši (med ~0,4–0,8 %), višjih multimernih oblik pa sploh niso zaznali, podobno kot v sevu JM109. Na koncu so testirali še, ali lahko ponovna transformacija multimernih plazmidov v sev JM109 poveča delež multimernih plazmidov celo v klonirnem sevu. V ta namen so vzorce MG1655, pridobljene neposredno po transformaciji, ponovno transformirali v JM109 in izolirali DNA iz kolonij za vsak tip plazmida. Pri plazmidu z visokim številom kopij so ugotovili, da so pri eni od treh kolonij skoraj vsi plazmidi v obliki dimerov. To kaže, da je dimerska oblika v sevu JM109 stabilna.
Zaključek
Preučili so nastanek multimernih oblik plazmidov z nanopornim sekvenciranjem pri sevih JM109 in MG1655. Pokazali so, da je v klonirnem sevu JM109 nastanek multimerov minimalen, medtem ko v sevu MG1655 močno narašča s številom kopij plazmida in s številom prenesenih kultur. Z izbrisom gena recA so uspešno zmanjšali nastanek multimerov in potrdili, da transformacija multimernih plazmidov vodi v visoko multimerne kulture. Raziskava opozarja na pomen poznavanja plazmidnih sekvenc za pravilno interpretacijo eksperimentalnih podatkov in poudarja, da je, še posebej pri nemodelnih organizmih, pomembno preveriti možnost nastanka multimerov
Literatura
[1] E. Vaisbourd, A. Bren, U. Alon, D. S. Glass: Preventing Multimer Formation in Commonly Used Synthetic Biology Plasmids. ACS Synth. Biol. 2025.
