Biogeneza in funkcija endogenih malih nekodirajočih RNA pri živalih

Uvod

Male nekodirajoče RNA so do 200 nukleotidov dolge molekule RNA, ki ne zapisujejo proteinov, temveč v celici opravljajo druge funkcije. Male strukturne RNA delujejo kot adapterji ali katalizatorji pri zorenju, modifikaciji ali translaciji daljših molekul RNA. Mednje štejemo male jedrne (snRNA), male nukleolarne (snoRNA) in prenašalne RNA (tRNA), navedene pa lahko tvorijo tudi fragmente z regulatorno vlogo. Poleg malih strukturnih RNA, poznamo še male regulatorne RNA, ki usmerjajo vezavo proteinov družine Argonaute na specifične mRNA ali virusne RNA, s čimer nadzorujejo izražanje genov in sintezo proteinov. Mednje spadajo mikro RNA (miRNA), male interferenčne RNA (siRNA) in s PIWI proteini povezane RNA (piRNA) [1].

Male strukturne RNA

tRNA

Male strukturne nekodirajoče RNA se izražajo v vseh vrstah celic, saj so potrebne za osnovne celične procese. Eden od primerov je tRNA, ki sodeluje pri translaciji mRNA v proteine. Iz tRNA se lahko sintetizirajo tudi krajši fragmenti, kot so tRNA polovice in tRNA fragmenti, ki sodelujejo pri različnih celičnih procesih. Fragmenti tRNA nastanejo kot odziv na celični stres in delujejo kot posrednik medgeneracijskega dedovanja. tRNA polovice nastanejo ob cepitvi zrele tRNA z angiogeninom. Angiogenin je RNaza z endonukleazno aktivnostjo, ki cepi tRNA v antikodonski zanki. Pri tej cepitvi nastaneta 5' konec in 3' konec tRNA polovice. 5' konec RNA polovice pomaga izpodriniti translacijska iniciacijska faktorja eIF4G in eIF4A z mRNA in inhibira translacijo. Nekatere tRNA polovice se vežejo na citokrom c in ovirajo nastanek apoptosoma, s čimer varujejo celico pred apoptozo. Pre-tRNA ali zrela tRNA se lahko cepita tudi na drugih delih, kar vodi do nastanka še krajših tRNA fragmentov [1, 2].

snRNA

snRNA so del spliceosoma, ki sodeluje pri izrezovanju intronov. Večina snRNA nastane s transkripcijo z RNA-polimerazo II, posttranslacijsko pa dobijo še m⁷G kapo. Pre-snRNA se nato transportira iz jedra v citoplazmo, kjer s pomočjo SMN kompleksa dozori in se sestavi v male jedrne ribonukleoproteinske delce (snRNP). Zreli snRNP se transportirajo nazaj v jedro, kjer se kopičijo v Cajalovih telescih. Tam poteče še 2'-O-metilacija in psevdouridilacija. Izjema pri sintezi snRNA sta U6 in U6atac, ki nastaneta s transkripcijo z DNA-polimerazo III in dozorita v jedru. Končna lokacija U6 je tako kot pri ostalih snRNP, Cajalovo telesce. Tudi pri snRNA so odkrili krajše fragmente, za katere je predlagana negativna regulacija izražanja genov, a točna biološka funkcija še ni znana [1].

snoRNA

snoRNA se nahajajo v jedrcu in usmerjajo posttranslacijske modifikacije rRNA, tRNA in snRNA s pomočjo metiltransferaz in psevdouridin sintaz. Te modifikacije pripomorejo k sestavi in delovanju evkariontskih ribosomov in spliceosomov. Sesalci in nekateri drugi organizmi imajo gene za snoRNA zapisane v intronih, kjer je običajno zapisan en gen snoRNA na intron. Gene v snoRNA prepisuje RNA-polimeraza II. Večina jih nastane z eksonukleaznim cepljenjem introna med njegovim izrezovanjem v procesu zorenja mRNA. snoRNA kotranskripcijsko vežejo razne proteine in pomožne faktorje ter tvorijo majhne nukleolarne ribonukleoproteine. Ti proteini tudi varujejo snoRNA pred razgradnjo. Ko so snoRNA zrele, se transportirajo v jedrce ali pa v Cajalova telesca. Primer delovanja je snoRNA s škatlo H/ACA, ki je 120-250 nukleotidov dolga molekula, ki se zaradi svoje strukture veže z RNA vezavnimi proteini NHP2, NOP10, GAR1 in psevdouridin sintazo. S tem omogoči metilacijo in psevdouridilacijo rRNA in snRNA [1].

Znanih je še več strukturnih RNA, med drugim imajo snoRNA svoje fragmente, ki niso dobro raziskani, obstajajo pa še druge, kot so vtRNA, ki tvorijo t. i. vault komplekse, ki imajo še neznano vlogo v celici, in Y RNA, ki naj bi sodelovale pri podvojevanju DNA [1].

Male regulatorne RNA

Male regulatorne RNA uravnavajo izražanje genov s cepitvijo in razgradnjo mRNA ali pa drugimi mehanizmi represije translacije. V to skupino malih nekodirajočih RNA spadajo miRNA, siRNA in piRNA, ki se med sabo razlikujejo v genomskem izvoru in načinu nastanka [1].

Za vse male regulatorne RNA je značilna vezava v proteine iz družine Argonaute (Ago). Za živali so iz te družine značilni proteini AGO, ki vežejo miRNA in siRNA, in PIWI, ki vežejo piRNA. Skupaj z regulatorno RNA proteini Ago tvorijo z RNA inducirani kompleks za utišanje (RISC), ki sodeluje pri cepitvi mRNA in represiji translacije. Regulatorna RNA kompleksu RISC omogoči vezavo in prepoznavanje tarčnih mRNA preko parjenja baz med regulatorno in tarčno RNA. Proteine Ago sestavljajo tri strukturne domene. Domeni PAZ in MID omogočata prepoznavanje in vezavo 3’- oz. 5’-konca male regulatorne RNA, domena PIWI pa nosi endonukleazno aktivnost, ki je potrebna za cepitev mRNA. Domena PIWI ni nujno funkcionalna pri vseh paralogih Ago, katalitično neaktivni Ago morajo za izvršitev represije translacije vezati še druge proteine [1, 3].

Poleg navedenih malih regulatornih RNA, proteini Ago vežejo tudi fragmente drugih vrst RNA, kot so na primer fragmenti tRNA, snRNA ali snoRNA [1].

miRNA

miRNA so okoli 22 nukleotidov dolge molekule RNA, ki nastanejo z zorenjem daljših transkriptov, imenovanih primarne miRNA (pri-miRNA), ki jih sintetizira DNA-polimeraza II. Za miRNA je značilna sekundarna struktura z apikalno lasnično zanko in dvoverižnim steblom z eno ali več izboklinami in/ali notranjimi zankami [1, 4].

Zorenje miRNA se prične v jedru, kjer pri-miRNA prepoznata proteina DROSHA in DGCR8, ki skupaj tvorita t. i. mikroprocesorski kompleks. Dimer DGCR8 služi prepoznavanju pri-miRNA in sidranju le-te na ribonukleazo DROSHA, ki cepi pri-miRNA v pre-miRNA, ki nato s pomočjo eksportinov zapusti jedro. V citosolu se na pre-miRNA vežeta ribonukleaza DICER1 in pomožni protein TARBP, ki veže dvoverižno RNA. DICER1 iz pre-miRNA odcepi apikalno lasnično zanko, s čimer nastane zrel miRNA-miRNA* dupleks, sestavljen iz usmerjevalne miRNA, ki bo pristala v končnem kompleksu RISC, in spremljevalne miRNA (miRNA*). S pomočjo šaperonov se nastali dupleks veže v enega izmed proteinov AGO, s čimer se tvori kompleks pre-RISC. Iz kompleksa se nato izloči spremljevalna miRNA in nastane zrel RISC. miRNA lahko nastanejo tudi po nekanonični poti iz intronov (t. i. mirtroni), ki se po izrezovanju vežejo v DICER1, nato pa se vključijo v kanonično pot biogeneze. Na mirtrone se lahko že pred procesiranjem veže tudi mikroprocesorski kompleks, čemur sledi še prilagojena pot zorenja miRNA in nalaganje v AGO ter nastanek RISC [1, 4].

Kompleks RISC se veže na mRNA in jo, če vsebuje katalitično aktiven AGO, razgradi, sicer pa omogoči vezavo različnih proteinskih kompleksov (npr. deadenilazni kompleks in kompleks za odstranjevanje kape), ki reprimirajo translacijo. Zgolj ena interakcija med miRNA in mRNA ne povzroči znatnega znižanja količine mRNA in nivoja translacije, vendar večina mRNA vsebuje več mest za vezavo miRNA, ki so dokaj kratka, kar omogoča sočasno in kooperativno tarčenje s strani različnih miRNA. Delovanje različnih miRNA je torej aditivno, vodi pa lahko tudi do več desetkratne represije translacije [1].

Zaključek

Male nekodirajoče RNA v celici opravljajo pester nabor nalog, marsikaj o njih pa je še neznanega. Čeprav so poti biogeneze večine malih nekodirajočih RNA dobro opisane, biološka vloga mnogih še ni pojasnjena. Z odkritjem fragmentov malih strukturnih RNA se je zabrisala meja med malimi strukturnimi in malimi regulatornimi RNA, kar k razumevanju regulacije izražanja genov dodaja nov nivo kompleksnosti. Poraja se tudi vprašanje, kako celice razlikujejo med produkti teh specifičnih poti in intermediati razgradnje drugih RNA. Na poti do odgovorov na ta in druga vprašanja bo potrebno razviti nove visokozmogljivostne metode za preučevanje funkcij posameznih malih nekodirajočih RNA pod različnimi celičnimi pogoji.

Viri

[1] K. Jouravleva in P. D. Zamore, „A guide to the biogenesis and functions of endogenous small non-coding RNAs in animals“, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., str. 1–24, jan. 2025, doi: 10.1038/s41580-024-00818-9.

[2] L. Zhu, J. Ge, T. Li, Y. Shen, in J. Guo, „tRNA-derived fragments and tRNA halves: The new players in cancers“, Cancer Lett., let. 452, str. 31–37, jun. 2019, doi: 10.1016/j.canlet.2019.03.012.

[3] E. S. Cenik in P. D. Zamore, „Argonaute proteins“, Curr. Biol., let. 21, št. 12, str. R446–R449, jun. 2011, doi: 10.1016/j.cub.2011.05.020.

[4] R. Shang, S. Lee, G. Senavirathne, in E. C. Lai, „microRNAs in action: biogenesis, function and regulation“, Nat. Rev. Genet., let. 24, št. 12, str. 816–833, dec. 2023, doi: 10.1038/s41576-023-00611-y.