Biogeneza in funkcija endogenih malih nekodirajočih RNA pri živalih

Uvod

Male nekodirajoče RNA so do 200 nukleotidov dolge molekule RNA, ki ne zapisujejo proteinov, temveč v celici opravljajo druge funkcije. Male strukturne RNA delujejo kot adapterji ali katalizatorji pri zorenju, modifikaciji ali translaciji daljših molekul RNA. Mednje štejemo male jedrne (snRNA), male nukleolarne (snoRNA) in prenašalne RNA (tRNA), navedene pa lahko tvorijo tudi fragmente z regulatorno vlogo. Poleg malih strukturnih RNA, poznamo še male regulatorne RNA, ki usmerjajo vezavo proteinov družine Argonaute na specifične mRNA ali virusne RNA, s čimer nadzorujejo izražanje genov in sintezo proteinov. Mednje spadajo mikro RNA (miRNA), male interferenčne RNA (siRNA) in s PIWI proteini povezane RNA (piRNA) [1].

Male strukturne RNA

tRNA

Male strukturne nekodirajoče RNA se izražajo v vseh vrstah celic, saj so potrebne za osnovne celične procese. Eden od primerov je tRNA, ki sodeluje pri translaciji mRNA v proteine. Iz tRNA se lahko sintetizirajo tudi krajši fragmenti, kot so tRNA polovice in tRNA fragmenti, ki sodelujejo pri različnih celičnih procesih. Fragmenti tRNA nastanejo kot odziv na celični stres in delujejo kot posrednik medgeneracijskega dedovanja. tRNA polovice nastanejo ob cepitvi zrele tRNA z angiogeninom. Angiogenin je RNaza z endonukleazno aktivnostjo, ki cepi tRNA v antikodonski zanki. Pri tej cepitvi nastaneta 5' konec in 3' konec tRNA polovice. 5' konec RNA polovice pomaga izpodriniti translacijska iniciacijska faktorja eIF4G in eIF4A z mRNA in inhibira translacijo. Nekatere tRNA polovice se vežejo na citokrom c in ovirajo nastanek apoptosoma, s čimer varujejo celico pred apoptozo. Pre-tRNA ali zrela tRNA se lahko cepita tudi na drugih delih, kar vodi do nastanka še krajših tRNA fragmentov [1, 2].

snRNA

snRNA so del spliceosoma, ki sodeluje pri izrezovanju intronov. Večina snRNA nastane s transkripcijo z RNA-polimerazo II, posttranslacijsko pa dobijo še m⁷G kapo. Pre-snRNA se nato transportira iz jedra v citoplazmo, kjer s pomočjo SMN kompleksa dozori in se sestavi v male jedrne ribonukleoproteinske delce (snRNP). Zreli snRNP se transportirajo nazaj v jedro, kjer se kopičijo v Cajalovih telescih. Tam poteče še 2'-O-metilacija in psevdouridilacija. Izjema pri sintezi snRNA sta U6 in U6atac, ki nastaneta s transkripcijo z RNA-polimerazo III in dozorita v jedru. Končna lokacija U6 je tako kot pri ostalih snRNP, Cajalovo telesce. Tudi pri snRNA so odkrili krajše fragmente, za katere je predlagana negativna regulacija izražanja genov, a točna biološka funkcija še ni znana [1].

snoRNA

snoRNA se nahajajo v jedrcu in usmerjajo posttranslacijske modifikacije rRNA, tRNA in snRNA s pomočjo metiltransferaz in psevdouridin sintaz. Te modifikacije pripomorejo k sestavi in delovanju evkariontskih ribosomov in spliceosomov. Sesalci in nekateri drugi organizmi imajo gene za snoRNA zapisane v intronih, kjer je običajno zapisan en gen snoRNA na intron. Gene v snoRNA prepisuje RNA-polimeraza II. Večina jih nastane z eksonukleaznim cepljenjem introna med njegovim izrezovanjem v procesu zorenja mRNA. snoRNA kotranskripcijsko vežejo razne proteine in pomožne faktorje ter tvorijo majhne nukleolarne ribonukleoproteine. Ti proteini tudi varujejo snoRNA pred razgradnjo. Ko so snoRNA zrele, se transportirajo v jedrce ali pa v Cajalova telesca. Primer delovanja je snoRNA s škatlo H/ACA, ki je 120–250 nukleotidov dolga molekula, ki se zaradi svoje strukture veže z RNA vezavnimi proteini NHP2, NOP10, GAR1 in psevdouridin sintazo. S tem omogoči metilacijo in psevdouridilacijo rRNA in snRNA [1].

Znanih je še več strukturnih RNA, med drugim imajo snoRNA svoje fragmente, ki niso dobro raziskani, obstajajo pa še druge, kot so vtRNA, ki tvorijo t. i. vault komplekse, ki imajo še neznano vlogo v celici, in Y RNA, ki naj bi sodelovale pri podvojevanju DNA [1].

Male regulatorne RNA

Male regulatorne RNA uravnavajo izražanje genov s cepitvijo in razgradnjo mRNA ali pa drugimi mehanizmi represije translacije. V to skupino malih nekodirajočih RNA spadajo miRNA, siRNA in piRNA, ki se med sabo razlikujejo v genomskem izvoru in načinu nastanka [1].

Vsem malim regulatornim RNA je skupna vezava v proteine iz družine Argonaute (Ago). Za živali so iz te družine značilni proteini AGO, ki vežejo miRNA in siRNA, in PIWI, ki vežejo piRNA. Skupaj z regulatorno RNA proteini Ago tvorijo z RNA inducirani kompleks za utišanje (RISC), ki sodeluje pri cepitvi mRNA in represiji translacije. Regulatorna RNA kompleksu RISC omogoči vezavo in prepoznavanje tarčnih mRNA preko parjenja baz med regulatorno in tarčno RNA. Proteine Ago sestavljajo tri strukturne domene. Domeni PAZ in MID omogočata prepoznavanje in vezavo 3’- oz. 5’-konca male regulatorne RNA, domena PIWI pa nosi endonukleazno aktivnost, ki je potrebna za cepitev mRNA. Domena PIWI ni nujno funkcionalna pri vseh paralogih Ago, katalitično neaktivni Ago morajo za izvršitev represije translacije vezati še druge proteine [1, 3].

Poleg navedenih malih regulatornih RNA, proteini Ago vežejo tudi fragmente drugih vrst RNA, kot so na primer fragmenti tRNA, snRNA ali snoRNA [1].

miRNA

miRNA so okoli 22 nukleotidov dolge molekule RNA, ki nastanejo z zorenjem daljših transkriptov, imenovanih primarne miRNA (pri-miRNA), ki jih sintetizira RNA-polimeraza II. Za miRNA je značilna sekundarna struktura z apikalno lasnično zanko in dvoverižnim steblom z eno ali več izboklinami in/ali notranjimi zankami [1, 4].

Zorenje miRNA se prične v jedru, kjer pri-miRNA prepoznata proteina DROSHA in DGCR8, ki skupaj tvorita t. i. mikroprocesorski kompleks. Dimer DGCR8 služi prepoznavanju pri-miRNA in sidranju le-te na ribonukleazo DROSHA, ki cepi pri-miRNA v pre-miRNA, ki nato s pomočjo eksportinov zapusti jedro. V citosolu se na pre-miRNA vežeta ribonukleaza DICER1 in pomožni protein TARBP, ki veže dvoverižno RNA. DICER1 iz pre-miRNA odcepi apikalno lasnično zanko, s čimer nastane zrel miRNA-miRNA* dupleks, sestavljen iz usmerjevalne miRNA, ki bo pristala v končnem kompleksu RISC, in spremljevalne miRNA (miRNA*). S pomočjo šaperonov se nastali dupleks veže v enega izmed proteinov AGO, s čimer se tvori kompleks pre-RISC. Iz kompleksa se nato izloči spremljevalna miRNA in nastane zrel RISC. miRNA lahko nastanejo tudi po nekanonični poti iz intronov (t. i. mirtroni), ki se po izrezovanju vežejo v DICER1, nato pa se vključijo v kanonično pot biogeneze. Na mirtrone se lahko že pred procesiranjem veže tudi mikroprocesorski kompleks, čemur sledi še prilagojena pot zorenja miRNA in nalaganje v AGO ter nastanek RISC [1, 4].

Kompleks RISC se veže na mRNA in jo, če vsebuje katalitično aktiven AGO, cepi in povzroči njeno razgradnjo, sicer pa omogoči vezavo različnih proteinskih kompleksov (npr. deadenilaznega kompleksa in kompleksa za odstranjevanje kape), ki reprimirajo translacijo. Zgolj ena interakcija med miRNA in mRNA ne povzroči znatnega znižanja količine mRNA in nivoja translacije, vendar večina mRNA vsebuje več mest za vezavo miRNA, ki so dokaj kratka, kar omogoča sočasno in kooperativno tarčenje s strani različnih miRNA. Delovanje različnih miRNA je torej aditivno, vodi pa lahko tudi do več desetkratne represije translacije [1].

endo-siRNA

Male interferenčne RNA so v mehanizmu delovanja in dolžini podobne miRNA. Njihov nastanek se razlikuje glede na rod živali; nekatere potrebujejo le Dicer, nekatere le od RNA odvisne RNA polimeraze, nekatere pa oboje. V organizmih brez od RNA odvisnih RNA polimeraz prekurzorji endo-siRNA lahko izvirajo iz transpozicijskih elementov, konvergentno prepisanih mRNA, RNA, ki so same sebi delno komplementarne, ali kodirajočih parov gen–psevdogen. V insektih se njihovo zorenje začne z vezavo ribonukleaze Dicer-2, ki za delovanje potrebuje protein, ki se veže na dvoverižno RNA (dsRBD), kar sta lahko Loqs-PD ali paralog R2D2. Dicer2 se postopoma premika po prekurzorju, da proizvede duplekse siRNA, ki se nato vežejo v protein Ago. Ta nato cepi spremljevalno verigo dozorele siRNA, ki se odstrani, da nastane zrel kompleks RISC. Rezanje spremljevalne verige lahko v nekaterih organizmih opravi tudi druga endonukleaza C3PO. V določenih organizmih je siRNA še dodatno zaščitena z 2’-O-metilacijo 3’-končne riboze, ki prepreči dodajanje nukleotidov in eksonukleazno razgradnjo na 3’-koncu. endo-siRNA delujejo večinoma v citoplazmi, obstajajo pa tudi jedrne endo-siRNA, ki lahko utišajo transkripcijo ali spremenijo strukturo kromosomov, regulirajo pa tudi nekaj kodirajočih genov za proteine [1].

V večini sesalskih celic se endo-siRNA ne sintetizirajo, saj vsebujejo drugačen protein Dicer, ki z aktivnim mestom ne more doseči dsRNA zaradi spremembe na N-končnem delu. Izjema so oociti miši in podgan ter embrionalne matične celice miši in ljudi, ki izražajo posebne oblike Dicer-ja z drugačno N-končno helikazno domeno, ki omogoča rezanje dsRNA v siRNA. V C. elegans poteka tudi dodatno ojačanje prvotnega endo-siRNA odziva s sintezo sekundarnih endo-siRNA s pomočjo od RNA odvisnih RNA polimeraz, ki s proteini dsRBD in homologi Dicer sintetizirajo komplementarno verigo. Ta veriga je nato obdelana do 26 nukleotidov dolgih RNA, ki so vezane v Ago proteine in spodbudijo nastanek 22 nukleotidov dolgih siRNA [1].

piRNA

piRNA so enoverižne RNA dolge okoli 26 nukleotidov, ki nastanejo iz transkriptov RNA-polimeraze II, ob zorenju pa za razliko od miRNA in siRNA ne sodeluje Dicer. Prekurzorji so dolge nekodirajoče enoverižne RNA, ki imajo na 5’-koncu kapo, so zlepljene in poliadenilirane. Sinteza zrelih piRNA je mešanica dveh mehanizmov; ping-pong cikla in nastanka fazirane piRNA, celoten proces pa se začne z endonukleazno cepitvijo ssRNA, ki poskrbi za nastanek 5’-končnega monofosfata potrebnega za interakcije s proteini Ago. Ta rezana RNA se imenuje pre-pre-piRNA in se veže v drug protein PIWI, kar kompleksu omogoča premik na zunanjo mitohondrijsko membrano, kjer endonukleaza Zucchini odcepi del vezan na protein. Tako rezan preostanek ima 5’-končen monofosfat, torej lahko deluje kot nov pre-pre-piRNA, se veže na drug protein PIWI in znova postane substrat za Zucchini. Proces več zaporednih cepitev s pomočjo endonukleaze tako vodi v nastanek zaporednih si piRNA oziroma fazirane piRNA. pre-piRNA dokončno dozori z obrezovanjem na 3’-koncu in nato 2’-O-metilacijo 3’-končne riboze. Če lahko te novo sintetizirane piRNA služijo kot piRNA, ki poskrbijo za začetno rezanje ssRNA prekurzorja do pre-pre-piRNA, se imenujejo posredovalne (angl. responder) piRNA, ki sprožijo ponovno serijo rezanj v tako imenovanem ping-pong ciklu. Oba mehanizma poskrbita za večjo učinkovitost sintetiziranih piRNA; ping-pong cikel poveča število piRNA, nastanek fazirane piRNA pa poskrbi za raznolikost s sintezo zaporednih piRNA iz enega prekurzorja [1, 3].

piRNA delujejo v jedru spolnih celic, kjer utišajo transpozone. Proteini Ago z vezano siRNA potrebujejo vsaj 11 sparjenih baznih parov za uspešno cepitev tarče, proteini PIWI z vezano piRNA pa jih potrebujejo vsaj 15, kar poskrbi za uspešno utišanje transpozonov brez neželenega utišanja drugih genomskih regij. Proteini PIWI so zaradi daljših vključenih piRNA manj občutljivi na neujemanje nukleotidov, zaradi česar mutacije ne preprečijo utišanja transpozonov. V nekaterih živalih lahko piRNA utišajo transkripcijo s histonskimi modifikacijami ali metilacijo DNA, prav tako pa regulirajo nekaj kodirajočih genov za proteine [1].

Zaključek

Male nekodirajoče RNA v celici opravljajo pester nabor nalog, marsikaj o njih pa je še neznanega. Čeprav so poti biogeneze večine malih nekodirajočih RNA dobro opisane, biološka vloga mnogih še ni pojasnjena. Z odkritjem fragmentov malih strukturnih RNA se je zabrisala meja med malimi strukturnimi in malimi regulatornimi RNA, kar k razumevanju regulacije izražanja genov dodaja nov nivo kompleksnosti. Poraja se tudi vprašanje, kako celice razlikujejo med produkti teh specifičnih poti in intermediati razgradnje drugih RNA. Na poti do odgovorov na ta in druga vprašanja bo potrebno razviti nove visokozmogljivostne metode za preučevanje funkcij posameznih malih nekodirajočih RNA pod različnimi celičnimi pogoji.

Viri

[1] K. Jouravleva in P. D. Zamore, „A guide to the biogenesis and functions of endogenous small non-coding RNAs in animals“, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., str. 1–24, jan. 2025, doi: 10.1038/s41580-024-00818-9.

[2] L. Zhu, J. Ge, T. Li, Y. Shen, in J. Guo, „tRNA-derived fragments and tRNA halves: The new players in cancers“, Cancer Lett., let. 452, str. 31–37, jun. 2019, doi: 10.1016/j.canlet.2019.03.012.

[3] E. S. Cenik in P. D. Zamore, „Argonaute proteins“, Curr. Biol., let. 21, št. 12, str. R446–R449, jun. 2011, doi: 10.1016/j.cub.2011.05.020.

[4] R. Shang, S. Lee, G. Senavirathne, in E. C. Lai, „microRNAs in action: biogenesis, function and regulation“, Nat. Rev. Genet., let. 24, št. 12, str. 816–833, dec. 2023, doi: 10.1038/s41576-023-00611-y.