Vloga RNA in RNA epigenetskih procesov pri HTLV-1

Človeški T-celični virus tipa 1 (HTLV-1) je onkogeni retrovirus, ki povzroča več hudih bolezni pri človeku, kot so odrasla T-celična levkemija/limfom (ATLL), HTLV-1-povezana mielopatija/tropska spastična parapareza (HAM/TSP), ter različna vnetna stanja, vključno z uveitisom, konjunktivitisom in dermatitisom.

HTLV-1 virusni genom poleg osnovnih strukturnih in encimskih genov (Gag, Pol, Pro in Env), vsebuje še unikatno pX regijo na 3' koncu virusnega genoma. Na tem mestu se nahaja zapis za protein Tax, ki je glavni aktivator transkripcije virusnih genov. Tax spodbuja nenadzorovano deljenje T-celic z deregulacijo izražanja proto-onkogenov ter z zaviranjem tumorsupresorskih proteinov, kot je p53. Poleg tega aktivira številne celične signalne poti, med njimi NF-κB, ki pod normalnimi pogoji uravnava imunski odziv in preživetje celic. Vendar pa njena kronična aktivacija, kot jo povzroči Tax, vodi v trajno proliferacijo, zaviranje apoptoze in s tem pomembno prispeva k celični transformaciji in razvoju levkemije. Na protismerni verigi pX regije se nahaja tudi zapis za protein HBZ, ki ima dvojno funkcijo, po eni strani lahko inhibira transkripcijo posredovano s Tax proteinom, in sicer tako, da se preko svoje levcinske zadrge veže na vezavno mesto za DNA na CREB (cAMP-odziven vezavni protein), kar moti NF-kB signalno pot. Po drugi strani pa direktno spodbuja proliferacijo T celic, z vezavo c-Jun proteina[1].

V jedru Tax in CREB ustvarita kompleks in se skupaj prestavita na U3 regijo na 5' koncu. Ko se zberejo še vsi kofaktorji, se prične transkripcija virusnih genov in regulatornih proteinov.

m6A metilacija

m6A je metilacija adenozinske baze na N6 mestu in je najbolj pogosta metilacija evkariontske RNA. To modifikacijo pogosto najdemo okoli stop kodonov in 3' nekodirajoče regije. V celici imamo tri skupine proteinov, ki so odgovorne za dinamičen potek nalaganja m6A modifikacij: 'zapisovalci', 'bralci' in 'odstranjevalci'. Zapisovalna proteina METTL3 in METTL14, sta odgovorna za prenos metilne skupine iz S adenizil metionina (SAM) na N6 adenozina.

Kot terapevtsko zdravilo za AML (akutna mioblastna levkemija) so uporabili majhno inhibitorno molekulo (STM2457), ki zavira delovanje METTL3 in tako zmanjša nivo m6A metilacij. Te metilacije nato odstranita 'odstranjevalca' ALKBH5 in FTO. Modificirane mRNA prepoznajo 'bralci' YTHDF1-3 in YTHDC1-2. Na 5' nekodirajočem koncu m6A metilacija lahko spodbuja translacijo ali pa spodbuja razgradnjo mRNA, odvisno od konteksta. YTHDF1 spodbuja CAP odvisno translacijo (preko CREB), YTHDF2 pa regulira razgradnjo m6A metilirane mRNA. Edini 'bralni' protein, ki se nahaja v jedru je YTHDC1, kjer je odgovoren za izrezovanje intronov in prehod m6A modificirane pre-mRNA iz jedra. Obsežne raziskave na področju m6A modifikacij pri retrovirusih so potekale zgolj na virusu HIV-1, šele pred kratkim so jih zaznali tudi v virusu HTLV-1. Odkrili so, da ima mRNA virusa HTLV-1 povečano število metilacij okoli pX regulatorne regije.

Virusna gena tax in hbz naj bi tudi bila m6A modificirana. Ko so preiskovali delovanje prej omenjene inhibitorne molekule, ki zavira metilacijo, so ugotovili, da je splošno zmanjšanje števila m6A modifikacij imelo nasprotna učinka pri teh dveh genih. Transkript gena tax naj bi se zmanjšal, hbz pa povečal. YTHDF1 naj bi zaviral ekspresijo tax in promoviral ekspresijo hbz.

Na podlagi številnih raziskav, so prišli do zaključka, da m6A modifikacija HTLV-1 RNA spremeni ekspresijo virusnih genov.

R-zanke

R-zanka je triverižna struktura nukleinskih kislin, sestavljena iz dvoverižnega hibrida RNA–DNA in izrinjene enoverižne DNA zanke. HTLV-1 uporablja reverzno transkripcijo za integracijo v gostiteljski genom. To mu omogoči lastni protein Tax, ki trajno aktivira NF-κB, družino transkripcijskih faktorjev, kar vodi v prekomerno ekspresijo genov za preživetje celic in nenadzorovano proliferacijo. Hiperaktivacija transkripcije poveča možnost za nastanek R-zank. Te blokirajo transkripcijo, zato se aktivirajo specializirani celični mehanizmi za obdelavo R-zank, kot je TC-NER. Če je poškodba na DNA, nastala zaradi R-zanke, preobsežna, gre takšna celica po TC-NER poti v senescenco ali apoptozo. V celičnih linijah, okuženih s HTLV-1 virusom, je TC-NER okvarjen, zmanjšano je namreč izražanje ključnih proteinov (XPF, XPG in CSB) za popravilo DNA v TC-NER poti. Okuženim celicam to omogoči, da preživijo kljub kopičenju R-zank. Možni terapevtski pristop za zdravljenje okužb s HTLV-1 je torej obnovitev TC-NER poti z zdravili, ki spodbudijo izražanje XPF, XPG in CSB, kar bi lahko uničilo okužene celice. Poleg tega so HTLV-1 celične linije občutljive na UV sevanje, saj TC-NER mehanizem popravlja tudi poškodbe na DNA, nastale zaradi UV sevanja. Za zdravljenje bolnikov, okuženih s HTLV-1, bi torej lahko uporabili UV/radioaktivno terapijo. [2]

IncRNA

lncRNA so dolge nekodirajoče RNA, daljše od 200 nukleotidov, ki se obsežno vključujejo v regulacijo genov. ANRIL je onkogena lncRNA, ki s svojo sposobnostjo uravnavanja epigenetskih sprememb in signalnih poti igra ključno vlogo pri uravnavanju celičnega cikla, apoptoze in pri razvoju raka, saj spodbuja proliferacijo HTLV-1-okuženih celic. Koncentracija ANRIL je povišana v celičnih linijah, okuženih s HTLV-1. ANRIL se lahko poveže s proteinom EZH2 in skupaj tvorita trojni kompleks s transkripcijskim faktorjem p65. Ta kompleks aktivira NF-κB signalno pot z vezavo na promotorje NF- κB in povečanjem transkripcijske aktivnosti njihovih genov, kar spodbuja proliferacijo in preživetje celic. ANRIL/EZH2 kompleks lahko tudi epigenetsko inaktivira tumor-supresorski gen p21 tako, da EZH2, ki je metil transferaza, metilira lizin na histonu H3K27 na promotorju p21. Gen za p21 je na ta način utišan, kar dodatno spodbuja celično proliferacijo. Glede na to, da se ANRIL pojavlja tudi pri drugih levkemijah, lahko ta lncRNA oziroma vmesni koraki v poti ANRIL/EZH2/NF-κB postanejo potencialna terapevtska tarča za celice, okužene s HTLV-1 virusom. [3]

mikroRNA

miRNA so enoverižne molekule RNA, dolge 18–24 nukleotidov, ki regulirajo izražanje genov, povezanih predvsem s proliferacijo in preživetjem celic. Komplementarno se vežejo na 3'UTR regije, kar povzroči razgradnjo mRNA ali zaviranje translacije. Številne miRNA delujejo v povezavi s proteinom Tax HTLV-1, ki aktivira NF-κB transkripcijske faktorje. Ti se s tem znebijo svojega inhibitorja, kar jim omogoči vstop v jedro, kjer aktivirajo promotor miRNA. miR-146a, miR-155 in miR-34a so regulirane na ta način. miR-146a v splošnem regulira imunski odziv, v okuženih celicah pa njeno prekomerno izražanje zavira imunski nadzor in omogoči njihovo preživetje. Povišana raven miR-155 v HTLV-1-pozitivnih celičnih linijah spodbuja proliferacijo T-celic in zavira apoptozo z inhibicijo tumor-supresorskih proteinov. Pri celicah, ki prekomerno izražajo miR-34a, ta vpliva na preživetje celic z zaviranjem apoptoze. Možna terapija, ki bi upočasnila proliferacijo celic, okuženih s HTLV-1, je zasnovana na uporabi NF-κB inhibitorjev, kar bi lahko zmanjšalo izražanje onkogenih miRNA. [4]

tRNA

Poleg tega da prinaša aminokisline na ribosom med procesom translacije, ima tRNA v celici tudi pomembno vlogo, ko pride do pomanjkanja aminokislin. Pomaga lahko pri razgradnji proteinov, saj deluje kot encim in v obliki Arg-tRNA protein transferaze prenese arginin na N-konce kratkoživečih proteinov, s tem jih destabilizira in omogoča razgradnjo, za pridobitev novih aminokislin [5]. Obstaja tudi drug način, ki vključuje vezavo tRNA na protein Gcn2, kar sproži kaskado reakcij preko katere pride do sinteze novih aminokislin.

Pri retrovirusih kot je HTLV-1 tRNA služi kot primer za nastajanje dsDNA. Poleg tega je pri virusih potreben premik bralnega okvirja, da lahko pride do izražanja določenih genov (npr. za gag-pol fuzijski protein), tega pa omogočajo različne aminoacil-tRNA, Asn-tRNA specifično pri virusu HTLV-1. Ta tRNA pogosto v svoji antikodonski zanki ne vsebuje močno modificirane baze quein. Z raziskavami so potrdili, da odsotnost queina v tRNA povzroča nekontrolirano proliferacijo celic in tvorbo tumorjev. To povzroča zmanjšana aktivnost encima tRNA gvanin transglikolaza, kar bi lahko bila tarča za terapevtska sredstva [6].

hbz RNA

Zapis hbz kodira za protein Hbz, njuni funkciji sta različni. Zapis se nahaja na 3' koncu LTR (long-terminal repeat), za to regijo je značilno, da je močno transkripcijsko aktivna, posledično je hbz pogosto edini tranksript, ki je dosledno izražen v vseh ATLL celicah.

Funkcionalna vloga hbz mRNA je, da spodbuja proliferacijo ATLL celic, torej ni zgolj podloga za transkripcijo in sintezo proteina Hbz. Hbz transkript se večinoma nahaja v jedru. Pri raziskavah z siRNA, ki je utišala gen hbz v ATLL celicah, so ugotovili, da utišanje močno zmanjšuje proliferacijo. Proliferacija je bila ohranjena le, če je bil v celicah prisoten nepoškodovan hbz transkript, prisotnost Hbz proteina pa na proliferacijo ni vplivala. Poleg tega lahko hbz mRNA aktivira promotor za survinin, ki je pomemben zaviralec apoptoze.

Kot že omenjeno, lahko protein Hbz zavira transkripcijo, ki jo nadzoruje Tax, poleg tega pa lahko tudi spodbuja vstop v S fazo celičnega cikla. Njegovo izražanje tako pripomore k nastajanju tumorjev ob okužbi s HTLV-1.

Nastajajoče RNA tehnologije

Ker s tradiocionalno metodo sekvenciranja genoma dobimo le informacijo o povprečnem izražanju genov v populaciji celic, so sodobne metode za sekvenciranje na ravni posamezne celice ključne za ugotavljanje kako posamezni geni vplivajo na funkcionalne lastnosti celic.

scRNA-Seq (sekvenciranje RNA na ravni posamezne celice) je metoda s katero lahko določamo vzorce izražanja DNA in RNA pri izbrani celici. Obstaja tudi alternativa – nanoporno neposredno sekvenciranje RNA (DRS = direct RNA sequencing). Ta oblika omogoča tudi zaznavanje postranskripcijskih modifikacij na nukleotidih in poliadenilacije.

V teoriji bi lahko uporabljali tudi tehnologijo Pacific Biosciences (PacBio), s katero bi prek vizualizacije sinteze nukleinskih lahko dosegli sekvenciranje RNA na ravni ene molekule. Vendar se ta metoda trenutno uporablja za DNA in bi jo bilo za RNA potrebno še prilagoditi.

Terapije na osnovi RNA

HTLV-1 virusni transkript vsebuje tudi regulativne in funkcionalne mehanizme, ki prispevaju k razvoju virusne okužbe v celici in ni samo podloga za sintezo proteinov.

Več RNA terapij je bilo že raziskanih:

- uporaba sintetičnih RNA za utišanje izražanja genov, ki spodbujajo nastajanje tumorjev;

- miR-28-3p, je miRNA za katero so ugotovili, da ovira reverzno transkripcijo in s tem onemogoča izražanje HTLV-1 genoma;

- mRNA cepivo v obliki lipidnih nanodelcev, ki sproži tvorbo protiteles, ki napadejo virusno ovojnico, je bilo testirano na živalih in pokazalo visoko raven učinkovitosti pri preprečevanju širjenja okužbe;

- ciljanje epitranskriptomskih modifikacij, kot je m6A, z STM2457 molekulami, kot je že omenjeno zgoraj, bi v zgodnjih fazah lahko pripomoglo k zmanjšanju širjenja okužbe;

- manj raziskana je terapija pri kateri bi prek inhibicije aminoacil-tRNA sintetaz preprečili nastanek ustreznih aminoacil-tRNA med sintezo beljakovin, a še vedno potencialna strategija.

Za razumevanje bioloških mehanizmov ob okužbi s HTLV-1 so ključne še nadaljnje raziskave na področju RNA in njenih modifikacij, ki bodo omogočile razvoj novih terapevtskih strategij.

Viri:

[1] Kobayashi, K. L. I., idr. „Kobayashi, Daimon, and Murata Respond“. Physical Review Letters, let. 52, št. 17, april 1984, str. 1569–1569. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1103/PhysRevLett.52.1569. [2] Elsakrmy, Noha, in Haissi Cui. „R-Loops and R-Loop-Binding Proteins in Cancer Progression and Drug Resistance“. International Journal of Molecular Sciences, let. 24, št. 8, april 2023, str. 7064. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3390/ijms24087064. [3] He, Yunlong, idr. „NF-κB-Induced R-Loop Accumulation and DNA Damage Select for Nucleotide Excision Repair Deficiencies in Adult T Cell Leukemia“. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, let. 118, št. 10, marec 2021, str. e2005568118. PubMed, https://doi.org/10.1073/pnas.2005568118. [4] Song, Zaowen, idr. „Long Noncoding RNA ANRIL Supports Proliferation of Adult T-Cell Leukemia Cells through Cooperation with EZH2“. Journal of Virology, let. 92, št. 24, november 2018, str. e00909-18. PubMed Central, https://doi.org/10.1128/JVI.00909-18. [5] Balzi, E., idr. „Cloning and Functional Analysis of the Arginyl-tRNA-Protein Transferase Gene ATE1 of Saccharomyces Cerevisiae.“ Journal of Biological Chemistry, let. 265, št. 13, maj 1990, str. 7464–71. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)39136-7. [6] Ren, Daixi, idr. „Emerging Roles of tRNA in Cancer“. Cancer Letters, let. 563, junij 2023, str. 216170. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1016/j.canlet.2023.216170 [7] Zaborske, John M., idr. „A Nutrient-Driven tRNA Modification Alters Translational Fidelity and Genome-Wide Protein Coding across an Animal Genus“. PLoS Biology, uredil Harmit S. Malik, let. 12, št. 12, december 2014, str. e1002015. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002015.