Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah
Izhodiščni članek: Anti-Pdc1p Nanobody as a Genetically Encoded Inhibitor of Ethanol Production Enables Dual Transcriptional and Post-translational Controls of Yeast Fermentations
Uvod
Kemijska industrija je pomemben gospodarski sektor, a hkrati tudi velik vir emisij toplogrednih plinov zaradi svoje odvisnosti od petrokemičnih surovin. Prehod na obnovljive vire, kot je biomasa, obeta zmanjšanje teh emisij in bolj trajnostno proizvodnjo. Bioprocesi poleg tega omogočajo delovanje pri nižjih temperaturah in zmanjšujejo uporabo okolju škodljivih snovi, kot so težke kovine in organska topila. Kljub tem prednostim pa mikrobna proizvodnja pogosto naleti na izziv kompromisa med rastjo celic in proizvodnjo želenih kemikalij. Rešitev tega problema predstavlja dinamični nadzor, ki deli fermentacijo na dve fazi: faza rasti in faza proizvodnje [1]. Za uspešno dvostopenjsko fermentacijo je pomembno v fazi rasti ohraniti presnovni pretok divjega tipa in nato v fazi proizvodnje usmeriti pretok v sintezo produkta. V fazi rasti se torej proizvodnja produkta zavira ali zmanjšuje, kar omogoča rast celic in povečanje biomase. Ko je dosežena zadostna raven biomase, se aktivira presnovna pot produkta. S tem se omogoči, da celice preusmerijo večjo količino ogljikovega toka v proizvodnjo produkta [2]. Prehod iz faze rasti v fazo proizvodnje se doseže z uravnavanjem izražanja genov. Večina sistemov dinamičnega nadzora temelji na transkripcijskem nadzoru presnovnih encimov, vendar pa imajo ti sistemi pomanjkljivosti, zlasti pri encimih z dolgo razpolovno dobo. Zaustavitev transkripcije namreč nima vpliva na proteine, ki so že nakopičeni v celici, zato se kot učinkovita dopolnitev uveljavlja posttranslacijski nadzor z uporabo nanoteles. Nanotelesa omogočajo natančno in specifično inhibicijo ključnih encimov, kar omogoča večjo prilagodljivost v fermentacijskih procesih [1].
V biotehnoloških procesih, ki vključujejo kvasovke je fermentacija glukoze v etanol pomembna, a pogosto neželena lastnost, še posebej kadar želimo preusmeriti ogljikov tok v druge koristne produkte. Ključni encim v tem procesu je piruvat dekarboksilaza 1 (Pdc1p), ki katalizira pretvorbo piruvata v acetaldehid, ki predstavlja prvi korak na poti k sintezi etanola [1].
Eksperimentalna strategija
Raziskovalci so razvili dvojni transkripcijski in posttranslacijski sistem za fermentacijo v kvasovki Saccharomyces cerevisiae. Uporabili so modro svetlobo za aktivacijo transkripcije glavne piruvat dekarboksilaze PDC1, ki je potrebna za rast celic in sočasno proizvodnjo etanola. Sledil je preklop v temo, ki inaktivira transkripcijo PDC1 in namesto tega aktivira transkripcijo nanotelesa NbJRI, ki deluje kot gensko kodiran inhibitor Pdc1p, ki se je nakopičila med fazo rasti. S tem so preusmerili presnovno pot, da so kvasovke proizvajale 2,3-butandiol (2,3-BDO) [1]. 2,3-BDO je brezbarvna, viskozna tekočina, ki se uporablja pri izdelavi farmacevtskih izdelkov, črnil, parfumov in je dobro topilo za organske spojine [3]. Da so omogočili popoln nadzor nad pretvorbo piruvata, so iz celic odstranili vse endogene piruvat dekarboksilaze in namesto njih uvedli različico PDC1, ki jo je bilo mogoče nadzorovati z uporabo modre svetlobe. Te seve so gensko spremenili s konstitutivno potjo za proizvodnjo 2,3-BDO. Vstavili so dva gena iz bakterije Bacillus subtilis, ki sta zapisovala za encima α-acetolaktat sintazo (AlsS) in α-acetolaktat dekarboksilazo (AlsD). Prav tako so povečali izražanje endogenega gena za 2,3-butandiol dehidrogenazo (BDH1) [1].
V predstavljenem sistemu so raziskovalci uporabili dve optogenetski vezji za natančen nadzor izražanja genov z uporabo modre svetlobe in teme. Prvo vezje, imenovano OptoQAMP1_PDC1, omogoča aktivacijo izražanja gena PDC1 v prisotnosti modre svetlobe. To vezje temelji na svetlobno občutljivem transkripcijskem faktorju EL222, ki se v modri svetlobi aktivira in sproži izražanje močnega transkripcijskega aktivatorja QF2. QF2 se nato veže na specifično zaporedje pred promotorjem in tako omogoča močno izražanje PDC1. Drugo vezje, OptoINVRT7_NbJRI, deluje nasprotno, in sicer v modri svetlobi sproži izražanje represorja Gal80p, ki prepreči delovanje aktivatorja Gal4p, s tem pa zavira izražanje gena coNbJRI pod promotorjem PGAL1. Ko svetloba ni prisotna, se Gal80p ne izraža, Gal4p pa zato ostane aktiven in omogoči izražanje coNbJRI [1].
To omogoča dvostopenjsko fermentacijo, ki se nadzoruje s svetlobo. V fazi rasti modra svetloba aktivira transkripcijo gena PDC1, kar omogoči rast celic v glukozi in kopičenje biomase z usmeritvijo presnove v proizvodnjo etanola. V fazi proizvodnje pa preklop v temo prepreči nadaljnjo transkripcijo PDC1, kar zmanjša rast celic in proizvodnjo etanola ter preusmeri presnovni tok proti proizvodnji 2,3-BDO. Izražanje coNbJRI v tej fazi pospeši prehod iz proizvodnje etanola v proizvodnjo 2,3-BDO z inaktivacijo Pdc1p [1].
Optimizacija fermentacijskih pogojev za proizvodnjo 2,3-BDO
V okviru optimizacije optogenetsko nadzorovane dvostopenjske fermentacije so raziskovalci preučevali vpliv dveh ključnih parametrov: gostote biomase (ρ) (izražene kot optična gostota (OD₆₀₀) ob preklopu iz svetlobnih pogojev v temo) ter časa inkubacije v temi pred začetkom proizvodne faze (θ). Za optimizacijo ρ so kvasne kulture z gensko spremenjenim sevom brez zapisa za nanotelo gojili pri različnih začetnih optičnih gostotah in ugotovili, da višja vrednost (ρ = 8) poveča proizvodnjo etanola, medtem ko nižja vrednost (ρ = 2) spodbuja proizvodnjo 2,3-BDO. Ker pa je nizka optična gostota povzročila nepopolno porabo glukoze in s tem večjo variabilnost, so se v nadaljevanju odločili za uporabo vmesnega območja (ρ = 4–8). Pri optimizaciji θ so primerjali pogoje θ = 0 h in θ = 4 h, vendar niso opazili večjih razlik v količini proizvedenega 2,3-BDO ali etanola. Zaradi poenostavitve postopka so potem izbrali krajši čas inkubacije [1].
Preučevanje vpliva izražanja nanoteles na titre in izkoristke etanola in 2,3-butandiola
V nadaljevanju raziskave so preverili, ali lahko izražanje nanotelesa proti Pdc1p dodatno izboljša preusmeritev ogljikovega toka iz proizvodnje etanola v proizvodnjo 2,3-BDO. V ta namen so primerjali fermentacije kvasnih kultur, ki so vsebovale prazen plazmid (sev Y1175) in tiste, ki so vsebovale temno inducibilno obliko coNbJRI (sev Y1176). Obe kulturi so gojili do OD₆₀₀ med 6 in 7,5, nato pa jih 70 ur inkubirali v temi v svežem glukoznem mediju. Rezultati so pokazali, da je izražanje coNbJRI skoraj podvojilo titre 2,3-BDO in hkrati skoraj prepolovilo proizvodnjo etanola. Ker je bila glukoza v obeh primerih popolnoma porabljena, so bile te razlike jasno vidne tudi v izkoristkih. Ugotovitve potrjujejo, da lahko nanotelo proti Pdc1p učinkovito inhibira aktivnost encima Pdc1p, s tem pa ne le uravnava rast, temveč tudi ciljno usmerja presnovo kvasovk v smer 2,3-BDO [1].
Vrednotenje vpliva izražanja nanoteles na kemijsko produktivnost
Za karakterizacijo kinetike presnovnega preusmerjanja iz proizvodnje etanola v proizvodnjo 2,3-BDO so raziskovalci spremljali fermentacijo v prvih 24 urah po indukciji izražanja nanotelesa coNbJRI. Ugotovili so, da je že po 5 urah izražanje coNbJRI povzročilo izrazito povečanje proizvodnje 2,3-BDO in zmanjšanje tvorbe etanola v primerjavi s kontrolnim sevom. Ta trend se je nadaljeval skozi celotno fermentacijo, saj je po 24 urah izražanje coNbJRI povzročilo več kot dvakrat višjo koncentracijo 2,3-BDO in hkrati 42 % zmanjšanje etanola glede na kontrolo. Kljub zamiku med indukcijo in kopičenjem funkcionalnega nanotelesa so rezultati pokazali, da coNbJRI učinkovito in hitro inhibira aktivnost encima Pdc1p ter posledično preusmerja tok ogljika v sintezo 2,3-BDO [1].
Zaključek
Kombinacija transkripcijskih in posttranslacijskih regulacijskih mehanizmov predstavlja učinkovito strategijo za dinamično preusmeritev presnovnih tokov v kvasovkah. Ta pristop usmerja presnovo stran od proizvodnje etanola k biosintezi ciljnih produktov. Če bi fermentacijske pogoje uravnavali le na ravni transkripcije, torej z represijo PDC1, bi to povzročilo časovni zamik v odzivu. Encim Pdc1p je namreč zelo stabilen in ima razpolovno dobo 11,5 ur. Zaradi aktivnosti preostalega encima v celici tudi po represiji PDC1, bi bil torej prehod iz faze rasti v fazo proizvodnje daljši. V primeru uporabe le posttranslacijskega nadzora pa ta ne bi bil zadosten, saj je PDC1 eden najmočneje izraženih genov v kvasovkah. Zato za učinkovito inhibicijo encima Pdc1p potrebujemo znižati njegovo izražanje. Takšen večplastni dinamični nadzor fermentacije povečuje produktivnost in selektivnost presnovnih poti. Hkrati skrajša prehod iz rasti celic v proizvodnjo produkta, kar pomembno prispeva k optimizaciji bioprocesov. Optimizacija procesa dinamičnega nadzora vključuje prilagajanje svetlobnih pulzov, kar bi omogočilo boljše uravnavanje ravnovesja minimalnih ravni encima Pdc1p, potrebnih za hitro rast celic. S tem bi hitreje dosegli stehiometrične nivoje coNbJRI, ki so potrebni za hitrejši preklop med rastjo celic in proizvodnjo produkta, kar bi povečalo donos in produktivnost. Možnost nadaljnjih izboljšav predstavljajo tudi delecija genov za zmanjšanje nastanka stranskih produktov in uravnavanje redoks ravnovesja [1].
Literatura
[1] Tang, Allison Y., idr. „Anti-Pdc1p Nanobody as a Genetically Encoded Inhibitor of Ethanol Production Enables Dual Transcriptional and Post-Translational Controls of Yeast Fermentations“. ACS Synthetic Biology, let. 14, št. 4, april 2025, str. 1072–83. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1021/acssynbio.4c00617.
[2] Venayak, Naveen, idr. „Engineering metabolism through dynamic control“. Current Opinion in Biotechnology, let. 34, avgust 2015, str. 142–52. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.copbio.2014.12.022.
[3] 2,3-Butanediol: Properties, Production And Uses. 11. december 2023, https://chemcess.com/23-butanediol-properties-production-and-uses/.
