Evolucija

Izhodiščni članek: [1]

Uvod

Ena izmed osrednjih ambicij sodobne sintezne biologije je konstrukcija umetnega sistema, ki bi imel temeljne lastnosti žive celice. Čeprav je bilo že več osnovnih življenjskih funkcij uspešno rekonstruiranih v umetnem okolju, funkcionalna sintetična celica, sposobna samostojnega obstoja in evolucije, še vedno presega naše trenutne zmožnosti. Evolucija je temeljna značilnost življenja, saj organizmom omogoča prilagajanje na spreminjajoče se okolje. Ključni pogoj za evolucijo je dednost – prenos informacij iz generacije v generacijo, ki ga omogoča molekularni mehanizem replikacije. Zato je vzpostavitev zanesljive in vitro replikacije eden ključnih korakov pri gradnji umetnega življenja. Prvi replikatorji v zgodovini so morda temeljili na RNA ali enostavnih avtokatalitskih sistemih. Danes poznamo več laboratorijsko rekonstruiranih samoreplikatorskih sistemov, ki ne temeljijo na DNA – med njimi RNA replikatorje in neencimatske reakcije. Ločitev genotipa in fenotipa, ki jo omogoča DNA, pa predstavlja prelomno točko v razvoju življenja, saj je odprla pot za bolj kompleksne evolucijske procese. Sprva so raziskovalci poskušali z replikacijo krožne DNA, vendar se je ta izkazala za nepraktično, saj so se pri replikaciji tvorili konkatemeri. Zato so pozornost preusmerili na linearne DNA genome, kot jih najdemo pri bakteriofagu Φ29. Ta sistem vsebuje začetke replikacije na obeh koncih in uporablja svojo lastno DNA polimerazo ter terminalni protein kot začetni primer, kar omogoča učinkovito replikacijo z malo dodatnih pomožnih proteinov. [1]

Načrtovanje DNK replikatorja in eksperimentalna vzpostavitev evolucijskega sistema

Avtorji članka so pri zasnovi sintetičnega DNA replikatorja izhajali iz bakteriofaga Φ29, ki okužuje bakterijo Bacillus subtilis. Na osnovi tega sistema so sintetizirali linearno DNA zaporedje, imenovano ori-p2p3, ki vključuje dva ključna gena, vstavljena pod močan T7 promotor: p2, ki kodira Φ29 DNA polimerazo, in p3, ki kodira terminalni protein TP, pomemben za iniciacijo replikacije. DNA zaporedje so kodonsko optimizirali za izražanje v E. coli. Pri eksperimentu so za izražanje genov uporabili sistem PURE, umetno sestavljen celični ekstrakt za transkripcijo in translacijo brez uporabe živih celic. Vse sestavine so enkapsulirali v liposome, katerih lipidna sestava posnema notranjo membrano E. coli, s čimer so ustvarili umetno, zaprto okolje za replikacijo in selekcijo. Ob prvih testih pomnoževanja so pri analizi vzorcev na agaroznem gelu poleg pričakovane, 3,2 kb dolge DNA, opazili tudi krajše fragmente dolžine 1,4 kb. Ti parazitski fragmenti bi lahko motili selekcijski proces, zato so pomnožke sekvencirali in ugotovili, da so posledica spajanja homolognih vodilnih sekvenc pred genoma p2 in p3. Sistem so nato optimizirali z uvedbo umetne T7 leader sekvence pred genom p3, kar je preprečilo nastanek parazitskih produktov. Za povečanje mutacijske raznolikosti so vključili tudi mutirano različico Φ29 DNA polimeraze brez popravljalne (eksonukleazne) aktivnosti. [1]

Evolucija DNA replikatorjev s prekinitvami

Da bi razvili sintetično protocelico, so najprej poskušali vzpostaviti standardni protokol za evolucijo DNA replikatorjev znotraj liposomov. DNA so enkapsulirali v liposome, joh inkubirali 24 ur pri 30 °C, izolirali, jo PCR-pomnožili, analizirali dolžino fragmentov na agaroznem gelu in jo znova enkapsulirali za naslednji cikel. Po dvanajstih ciklih evolucije so opazili petkratno povečanje koncentracije DNA. V ločenem poskusu, brez analize dolžine pomnožkov na agaroznem gelu, se količina DNA ni bistveno spreminjala. V nadaljevanju so testirali mutacijo F62Y v Φ29 DNA polimerazi. Izvedli so enajst ciklov evolucije, po osmem ciklu pa so inkubacijski čas skrajšali na štiri ure, s čimer so povečali selekcijski pritisk. Posledično se je učinkovitost DNA replikacije zmanjšala, zato so eksperiment zaključili. Analiza z NGS je pokazala kontaminacijo iz drugega eksperimenta (Int-WT1), vendar so rezultati kljub temu potrdili, da kompartmentalizirana IVTTR replikacija omogoča preživetje DNA replikatorjev. [1]

Polkontinuirana evolucija in pomen kompartmentalizacije

Pri polkontinuirani evoluciji so DNA, pomnoženo v liposomih, s pomočjo freeze-thaw (FT) metode prenesli v nove liposome. Pri tem postopku se približno polovica DNA izgubi v okolico, preostanek pa ostane v liposomih. Eksperimente so izvajali z 16-urno inkubacijo pri 30 °C in 100-kratnim redčenjem med posameznimi cikli. Dodali so DSB proteine, ki omogočajo replikacijo tudi zunaj liposomov, da se pri spiranju med cikli ne bi izgubil nabor mutacij, prav tako tudi niso dodali DNAze I, saj bi ta encim lahko vstopil v liposome in razgradil znotrajcelično DNA. PCR analiza je pokazala, da se celotna 3,2 kb DNA ohranja skozi vsaj pet evolucijskih ciklov. Kvantitativna PCR je potrdila, da koncentracija p2 gena v liposomih sledi skupni količini DNA, medtem ko v bulk pogojih hitro upade zaradi prevlade parazitskih transkriptov. [1]

Pojav DNK mutacij ter njihova evolucija

Raziskovalci so s pomočjo sekvenciranja naslednje generacije (NGS) spremljali DNK mutacije med evolucijo v različnih eksperimentalnih pogojih (Int-WT1, Int-WT2, Int-Mut, Con-WT). Na podlagi dobljenih podatkov so izračunali frekvence posameznih mutacij ter analizirali, katere so postale prevladujoče v populaciji. V eksperimentu Int-WT1 so se nekatere mutacije pojavile že v zgodnjih ciklih, a kasneje izginile, medtem ko sta mutaciji S79G in A80T v genu za DNK polimerazo postali prevladujoči v poznejših krogih. Mutacija S79G se je pogosto pojavljala skupaj s tiho mutacijo V247V, ki lahko vpliva na stabilnost mRNA ali hitrost translacije. V Int-WT2 sta se prav tako pojavili S79G in A80T, vendar z nižjo frekvenco, kar članek pojasnuje kot zametek konvergentne evolucije. V Int-Mut so že zgodaj nastale številne mutacije, ki so hitro postale dominantne. Ključne spremembe so bile prisotne v genu p2 (npr. F62Y, A80T, E158G) in p3 (S189G, L263P). Posebej zanimivi sta bili dve tihi mutaciji v homopolimernih regijah (AAAAAA), ki lahko zmanjšata pogostost napak DNK polimeraze pri podvajanju in ribosomske zdrse. V Con-WT so zaznali bistveno manj mutacij v primerjavi z Int-WT1 in Int-WT2, kar potrjuje, da PCR pomnoževanje med cikli poveča kopičenje mutacij. Nižja stopnja mutacij v Con-WT je obenem tudi posledica mešanja vsebine med liposomi, zaradi česar koristni encimi (fenotipi) niso nujno več povezani z lastno DNK (genotipom). To oslabi selektivni pritisk, saj evolucija ne more učinkovito "nagraditi" mutacij, ki izboljšajo funkcijo. [1]

Karakterizacija mutacij

Da bi razumeli, kako posamezne mutacije vplivajo na učinkovitost replikacije, so raziskovalci podrobno preučili dve najpogostejši mutaciji – S79G in A80T – v genu p2, ki kodira DNK polimerazo (DNAP). Pripravili so vse možne kombinacije teh mutacij (posamične in dvojno mutirane proteine), jih izražali ter testirali v liposomskem IVTTR sistemu in tudi v raztopini zunaj liposomov, da bi ocenili, ali imajo mutacije splošen ali okoljsko specifičen učinek.Rezultati so pokazali, da sta obe mutaciji povzročili statistično značilno povečanje količine podvojene DNK znotraj liposomov. Zanimivo pa je, da kombinacija obeh mutacij na istem proteinu ni prinesla dodatne izboljšave – v nekaterih primerih je bila celo manj učinkovita od posameznih mutacij. Ta ugotovitev jasno kaže, da gre za funkcionalne mutacije, ki neposredno prispevajo k izboljšani replikaciji v določenem okolju in niso zgolj spremljevalke naključne evolucije. Z nadaljnjo analizo kinetike replikacije so ugotovili, da mutacija S79G pospeši hitrost podvajanja DNK. Vendar pa enake mutacije, testirane v raztopini brez liposomov, niso pokazale nobenega vpliva na učinkovitost replikacije, kar kaže, da je njihova evolucijska prednost specifična za liposomsko mikrookolje. Da bi razjasnili mehanizem delovanja mutacij – ali vplivajo na stabilnost DNK ali neposredno na aktivnost DNAP – so raziskovalci encim izolirali, očistili in testirali v odsotnosti DNK matrice. Rezultati so pokazali, da nobena od mutacij ni izboljšala aktivnosti encima samega, kar pomeni, da so njihovi učinki odvisni od interakcije z DNK matrico znotraj liposoma. Zamenjave aminokislin torej ne povečajo splošne encimske aktivnosti, temveč učinkujejo le v specifičnem kontekstu. Dodatno so preučili tudi vpliv tihih mutacij, ki ne spreminjajo aminokislinskega zaporedja, a lahko vplivajo na stabilnost DNK, odpravo homopolimerov, učinkovitost translacije ali sekundarno strukturo mRNA. Vse testirane tihe mutacije so dosegle enako raven replikacije kot izvorna DNK, kar nakazuje, da njihov vpliv ni neposreden in deluje v kombinaciji z drugimi mutacijami. [1]

Zaključek

V tej študiji so avtorji predstavili de novo pristop za sestavo virusa VSV, ki pomeni pomemben tehnični napredek glede hitrosti, prilagodljivosti in učinkovitosti pri ustvarjanju VSV-vektorjev. Medtem ko so modularna sestava DNA in reverzna genetika dobro uveljavljene pri pozitivno orientiranih RNA virusih (npr. SARS-CoV-2), so tovrstne metode redko uporabljene pri negativno orientiranih virusih, kot je VSV. V raziskavi so izpostavili tudi ključne prednosti sintezne virologije in sicer, da ni potrebe po obstoječem plazmidu, saj se virusi lahko načrtujejo in sestavijo zgolj na podlagi digitalne sekvence. Pri sintezni virologiji imamo tudi popoln nadzor nad genetsko zasnovo, ki omogoča natančne mutacije, bolj čisto sestavo in daljše sekvence brez PCR napak, ter manj napak v splošnem kontekstu v primerjavi s tradicionalnimi metodami, saj je manj možnosti za kontaminacijo ali delne produkte. Kljub vsem prednostim pa ima ta sintezni pristop tudi razne omejitve kot je predvsem odvisnost od točne referenčne sekvence, saj se tudi v javnih bazah podatkov lahko pojavijo določene napake, enako kot se jim je v tem poskusu, saj so ugotovili 14 nukleotidnih razlik, ki so vplivale na več virusnih genov. Vendar kljub tem izzivom pa ta platforma omogoča hitro spreminjanje genomov in tako imajo raziskovalci orodje za razvoj novih cepiv, terapevtskih vektorjev ter onkolitičnih virusov in tako predstavlja sintezna virologija izjemen potencial za pospešitev razvoja novih biomedicinskih rešitev. [1]

Literatura

[1] Abil, Z., Restrepo Sierra, A. M., Stan, A. R., & others. (2024). Darwinian evolution of self-replicating DNA in a synthetic protocell. Nature Communications, 15, 9091. https://doi.org/10.1038/s41467-024-53226-0