Programabilen ribocim za prenos signala RNA
Izhodiščni članek: A programmable ribozyme for RNA signal transduction
Uvod
Do zdaj ni bila znana biološka molekula, ki bi prepoznala specifično zaporedje RNA in neposredno, brez vmesnih stopenj, sprožila signal v obliki različnih efektorskih nekodirajočih molekul RNA. Čeprav je bilo do sedaj odkritih kar nekaj molekul RNA, ki so bile uporabljene kot biosenzorji ali pa so imele avtokatalitično sposobnost, takšne lastnosti niso bile do sedaj zajete v eni sami molekuli, ki bi vsebovala samo nukleinske kisline.[1,2] Avtorji v članku predstavljajo molekulo RNA, ki jo je mogoče načrtno spremeniti tako, da se veže na poljubna zaporedja RNA. Ta vezava sproži samocepitev, pri kateri poleg ostanka prvotne molekule nastane tudi krajše zaporedje RNA. Slednje lahko služi kot funkcionalna molekula za različne aplikacije, na primer ncRNA, sgRNA, shRNA ali aptamer. Molekule s takšno samocepitveno sposobnostjo so poimenovali UNBAR (angl. UNlocked by Activating RNA). Kot navajajo raziskovalci, bi lahko takšne molekule uporabljali v sintezni biologiji, diagnostiki in pri uravnavanju izražanja genov.
Načrtovanje in lastnosti ribocima
Izvedba eksperimentov in delovanje ribocima
Za izvedbo eksperimentov so raziskovalci naročili zaporedja DNA, ki so jih z metodo in-vitro transkripcije prepisali v večje količine molekul RNA. Testiranje cepitve je potekalo v nadzorovanem in-vitro sistemu, kjer so v mešanico dodali tako sprožilno RNA (50 nM) in ribocim (200 nM), ter inkubirali več ur, da je prišlo do reakcije. Uspešnost cepitve so preverili z denaturirajočo pulzno poliakrilamidno gelsko elektroforezo (PAGE). Da bi bili reultati vidni, so gel barvali s SYBR Gold. Raziskovalci so želeli načrtati ribocim, ki bi se ob vezavi tarčne molekule RNA na specifično mesto aktiviral in sprostil krajši fragement RNA. Izhajali so iz lasničnega ribocima HpRz[3], ki ima v obliki dimera lastnost dvojne cepitve, s čimer se sprosti kratek osrednji del RNA. Že predhodne raziskave so pokazale, da je za katalitično atkivnost ključna struktura heliksa 4 (H4). Predpostavili so, da na določenih mestih v tem heliksu natančno zaporedje ni kritično, zato so sklepali, da ga je mogoče spremeniti brez negativnega vpliva na katalitično aktivnost. Lasnični ribocim so modificirali tako, da se v običajnih fizioloških pogojih brez prisotnosti sprožilne RNA heliks 4 ne tvori, temveč ostane v nestabilni enoverižni konformaciji. Poleg dolžine heliksa H4 so optimizirali tudi njegovo nukleotidno sestavo s spreminjanjem specifičnih baznih parov na posameznih mestih. Tako so dosegli, da se šele ob dodatku komplementarne sprožilne RNA, ki se hkrati veže na prosta konca obeh verig ribocima, kompleks stabilizira s tvorbo vijačnice H4. Zaradi zrcalne strukture in vezave tarčne RNA na obeh straneh pride do dvojne cepitve, kar sprosti vdelani produkt. S številnimi optimizacijami, kot so krožne permutacije delov ribocima, zmanjšanje komplementarnosti med produktom in ribocimom ter uvedba štirismernega stičišča (4-way junction), so razvili optimalno različico senzorja. Ta različica zagotavlja idealno ravnovesje med stabilnostjo in aktivnostjo, kar preprečuje spontano cepitev brez sprožilca, hkrati pa omogoča hiter odziv ob njegovi prisotnosti.
Izboljšave ribocima
V naslednji fazi so raziskovalci želeli poenostaviti strukturo ribocima in podrobneje preučiti njegov katalitični mehanizem. Preverili so, katera od dveh zank B je ključna za dvojno cepitev oziroma ali sta za sprostitev produkta nujno potrebni obe. Rezultati so pokazali, da do cepitve pride že, če je funkcionalna le ena od zank. Le v primeru sočasne mutacije v obeh katalitičnih zankah do cepitve ne pride. Na podlagi teh ugotovitev so sklepali, da je mogoče predhodni ribocim poenostaviti v enoverižno molekulo RNA, kar bi bistveno olajšalo njegovo načrtovanje in sintezo. Za vse nadaljne stopnje poskusa so tako zasnovali enoverižni ribocim z eno samo katalitično zanko B, ki je, vsaj glede na podatke, ohranil približno enako učinkovitost cepitve kot prvotni kompleks. Da bi preverili programabilnost ribocima, so načrtali različice ribocima, ki prepoznajo specifične sprožilne molekule RNA. Delovanje so testirali na različnih fragmetnih miRNA iz genov E, Orf1ab in S virusa SARS-CoV-2. Analiza rezultatov z pulzno gelskp elektroforezo je potrdila prisotnost cepitve pri vseh testiranih vzorcih, kar dokazuje, da je ribocim učinkovito orodje, ki ga je mogoče uporabiti za zaznavo različnih tarč.
Prenos in ojačitev signala
Za diagnostične aplikacije je ključno, da je metoda občutljiva in da se prisotnost majhne količine sprožilca odraža v močnem signalu. Ta potencial so preverili tako, da sop merili količino sproščenega produkta pri naraščajočih koncentracijah ribocima, medtem ko je koncentracija sprožilne RNA ostala konstanta. Ugotovili so, da količina produkta narašča s koncentracijo dodanega ribocima. Tudi ko je koncentracija ribocima močno presegla koncentracijo sprožilca, se je signal znatno povečal (pri 16-kratnem presežku ribocima so zaznali 7-kratno ojačitev signala glede na začetno količino sprožilca). To potrjuje, da ena molekula sprožilne RNA aktivira več molekul ribocima. Poleg ojačitve so testirali tudi specifičnost vezave zaporedij, ki se razlikujejo v posameznih bazah na različnih mestih. Rezultati so pokazali, da se učinkovitost dvojne cepitve spreminja glede položaj mutacije. Pri določenih se je sposobnost cepitve celo povečala, pri drugih pa se je zmanjšala za okoli 90-%. S tem so dokazali, da je s pravilnim načrtovanjem mogoče doseči razlikovanje med zaporedji, ki se razlikujejo za zgolj en nukleotid.
Sproščanje funkcionalnih molekul RNA
Ugotovitev, da je mogoče v ribocim vstaviti poljubno zaporedje RNA, ki bo končni produkt cepitve, ponuja razmislek, ali bi te molekule lahko služile kot funkcionalni elementi, na primer sgRNA, shRNA ali aptameri. Da bi to preverili, so raziskovalci zasnovali tri različice UNBAR, od katerih je vsaka vseboavla eno izmed omenjenih zaporedij. Po inkubaciji s specifično sprožilno RNA so pri vseh zaznali sprostitev tarčnega produkta, medtem ko je bila v odsotnosti sprožilne RNA količina razcepljene RNA zanemarljiva. Ker sistem omogoča vgradnjo raznolikih zaporedij RNA, so poskusili ustvariti senzor, ki bi ob prisotnosti tarče sprožil fluorescentni signal. V ribocim so vstavili zaporedje za aptamer Spinach[4], ki veže barvilo DFHBI. V prostem stanju barvilo ne fluorescira, ob vezavi na sproščeni aptamer pa odda močno svetlobo. Rezultati so potrdili, da prisotnost tarčne RNA (v tem primeru delček gena virusa SARS-CoV-2) sproži cepitev in sprostitev aptamera, kar vodi do pojava fluorescence. S tem so pokazali, da se UNBAR lahko uporabi kot diagnostično orodje za zaznavo 25 nM patogene RNA.
Delovanje v celicah
Večino predhodnih poskusov so izvedli v sistemih in-vitro, vendar pa so želeli preveriti delovanje sistema UNBAR tudi v živih celicah. V ta namen so zasnovali senzor, ki se aktivira ob prisotnosti sprožilne RNA (v tem primeru let-7) v zarodkih cebrice. Aktivacija sproži urejanje gena GFP preko sistema CRISPR/Cas. UNBAR je bil konstruiran tako, da ob uspešni cepitvi sprosti sgRNA, ki v kompleksu s proteinom Cas9 izbije gena za GFP, kav vodi v prenehanje fluorescence. Rezultati so potrdili, da se UNBAR v celicah uspešno cepi in omogoča urejanje genoma. V primerjavi s pozitivno kontrolo, kjer so sgRNA vbrizgali neposredno v celico, je bila učinkovitost pri sistemu UNBAR nižja, saj v celici težje pride do dvojne cepitve. Da bi dokazali, da cepitev sproži prav specifična RNA let-7, zato so v celice dodali inhibitor morfolino, ki veže sprožilno RNA in prepreči njeno interakcijo z ribocimom. Ob dodatku inhibitorja ni prišlo do zmanjšanja fluorescence, kar potrjuje, da je za aktivacijo senzorja nujna prisotnost sprožilne RNA. Podobne poskuse so izvedli tudi na človeški celični liniji HEK293T, s čimer so dokazali potencial sistema za selektivno urejanje genoma v tarčnih celicah, ki vsebujejo določene transkripte, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za ciljno uničenje rakavih celic.
Zaključek
Raziskave so potrdile, da je UNBAR prvi ribocim z dvojnim cepitvenim mestom, ki omogoča vgradnjo in sprostitev poljubne kratke molekule RNA ob vezavi specifičnega sprožilca. UNBAR je tudi visoko specifičen in zmožen zaznave nizkih koncentracij tarč ter izjemna modularnost, saj ga je mogoče hitro prilagoditi za zaznavo različnih zaporedij. Ključni prednosti UNBAR sta tudi neodvisnost od pomožnih proteinov ali kofaktorjev ter sposobnost avtonomne ojačitve signala. Kljub številnim prednostim pa za sistem UNBAR obstajajo številne izboljšave. Ena glavnih omejitev je t.i. brazgotina (angl. scar), ki je ostanek nukleotidov na koncih sproščene RNA, ki lahko v določenih primerih inhibira njeno delovanje. Poleg tega lahko pride do nepopolne cepitve in stabilnost molekul RNA, kar vse posledično vpliva tudi na delovanje sistema. Vsekakor UNBAR odpira nove možnosti na številnih področjih. Kot diagnostično orodje bi lahko omogočil natančno identifikacijo patogenov kot je SARS-CoV-2. V biologiji in medicini omogoča tarčno sproženo urejanje genoma s pomočjo sistema CRISPR/Cas9, kar bi lahko pomenilo preboj pri zdravljenju raka. Nenazadnje pa lahko deluje tudi kot odličen biosenzor, kar bi imelo lahko številne aplikacije v sintezni biologiji.
Literatura
[1] G.S. Filonov, J.D. Moon, N. Svensen, S.R. Jaffrey, Broccoli: rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution, J Am Chem Soc 136 (2014) 16299–16308. https://doi.org/10.1021/ja508478x.
[2] K. Huang, F. Doyle, Z.E. Wurz, S.A. Tenenbaum, R.K. Hammond, J.L. Caplan, B.C. Meyers, FASTmiR: an RNA-based sensor for in vitro quantification and live-cell localization of small RNAs, Nucleic Acids Res 45 (2017) e130. https://doi.org/10.1093/nar/gkx504.
[3] M. Pérez-Ruiz, A. Barroso-delJesus, A. Berzal-Herranz, Specificity of the Hairpin Ribozyme: SEQUENCE REQUIREMENTS SURROUNDING THE CLEAVAGE SITE *, Journal of Biological Chemistry 274 (1999) 29376–29380. https://doi.org/10.1074/jbc.274.41.29376.
[4] J.S. Paige, K. Wu, S.R. Jaffrey, RNA mimics of green fluorescent protein, Science 333 (2011) 642–646. https://doi.org/10.1126/science.1207339.
