Verižna reakcija s polimerazo (PCR)
Raziskave na področju raziskovanja genomov organizmov ter projekt človeški genom so omogočile dostop do informacij zaporedja genov. Za takšno biokemijsko analizo potrebujemo večje količine sekvence genov, kar nam dandanes omogoča metoda PCR. PCR ali verižna reakcija s polimerazo je proces, v katerem lahko pridobimo večje količine določenega zaporedja, ki lahko meri največ 6000 baznih parov. Odkril jo je Nobelov nagrajenec Kary Mullis leta 1983.
PCR je tako uporabna, ker lahko tri stopnje – denaturacijo, hibridizacijo in sintezo DNA – večkrat ponovimo s preprostim spreminjanjem temperature reakcijske mešanice. Vsaka na novo sintetizirana veriga DNA lahko služi kot matrica, tako da koncentracija takšne DNA narašča eksponentno. V postopku z dvajsetimi cikli se fragment DNA pomnoži okrog milijonkrat.
Principi metode
Za reakcijo z verižno polimerazo potrebujemo:
- 2 sintetična oligonukleotida dolga po približno 20 nukleotidov, s komplementarno sekvenco
- termostabilno polimerazo
- vse štiri deoksiribonukleozidtrifosfate
Oligonukleotidi služijo pri podvojevanju kot primerji. Od tam naprej podaljšuje DNA verigo encim dna polimeraza. Pri tem sta 3' konca verig orientirana drug proti drugemu. Na novo sintetizirani verigi ločimo s segrevanjem pri temperaturi (približno 95°C). Ko se verigi ločita, ju ponovno ohladimo. Pri nižji temperaturi lahko ponovno poteka dodajanje novih deoksiribonukleozidtrifosfatov. Če postopek večkrat ponovimo, dobimo eksponentno število sekvenc, ki smo jih želeli podvojiti. Vsa stvar se odvija v več, spodaj opisanih, korakih.
Iniciacijska stopnja: Vključuje segrevanje reakcijske zmesi na temperaturi 94-95°C (če uporabljamo termostabilne polimeraze, segrevamo pri temperaturi 98°C), pri čemer tako stanje ohranimo do 9 minut.
Denaturacijska stopnja: Ta korak je prvi stopnja v ciklu metode PCR v kateri segrejemo reakcijsko zmes na 94-98 °C za 20-30 sekund, kar povzroči denaturacijo DNA. Pri tem se porušijo vodikove vezi med baznimi pari komplementarnih DNA verig, dobimo ločeni komplementarni verigi.
Stopnja pripenjanja: Stopnja pripenjanja traja približno pol minute in se odvija pri temperaturi 50-65°C, saj je optimalno delovanje primerjev ravno v tem temperaturnem območju. Takrat se primerji pripnejo na komplementarno verigo DNA. V tej fazi sodeluje tudi DNA polimeraza, ki se veže na primer in začne sintezo DNA.
Podaljševalna stopnja: stopnja je odvisna od polimeraze, ki jo pri tem postopku uporabimo; npr Taq polimeraza ima svoje optimalno območje delovanja pri 75-80°C. Na splošno pa se v tej stopnji pripenjajo deoksiribonukleotidi s pomočjo encim DNA polimeraze na osnovno DNA verigo. Sinteza deoksiribonukleotidov poteka v smeri od 5' do 3'. Pri tem se 5' fosfatna skupina deoksiribonukleozidtrifosfata poveže s 3' hidroksilno skupino nastajajoče DNA verige.
Zaključno podaljševanje: Ta korak se odvija pri temperaturi 70-74°C in traja približno 5-15 minut po zadnjem PCR ciklu. V tem procesu encim »preveri«, če se je celotna veriga podvojila.
Uporaba
Iznajdba PCR metode je veliko pripomogla k detekciji raznovrstnih bolezni. Tako danes s pomočjo le-te zaznajo prisotnost kužnih bakterij in virusov pri ljudeh. Uporabna pa je tudi pri potrjevanju infekcije s HIV. Te potrdijo s testi, ki v serumu zaznavajo protitelesa proti virusnim proteinom. Brez te metode bi HIV zaznali zelo pozno, saj se taka koncentracija pri kateri bi lahko zaznali virusna protitelesa, pri človeku tvori šele po približno šestih mesecih. Z metodo PCR pa lahko zaznamo virusno DNA že na samem začetku. Posebej pomembna je uporaba te metode pri dojenčkih, pri katerih namreč ne morejo izvesti testa s protitelesi, saj imajo še do 15 mesecev po rojstvu materina protitelesa. Drugi primeri medicinske uporabe PCR so zgodnje odkrivanje tuberkuloze in raka, predvsem levkemije in analiza majhnih vzorcev amnijske tekočine za odkrivanje genetskih nenormalnosti zarodkov.
