Odkritje in delovanje kompleksa RISC
Zgradba kompleksa RISC
RISC (RNA induced silencing complex) je encimski kompleks, ki sodeluje pri procesu utišanja genov. Aktivno obliko kompleksa RISC sestavljajo proteini družine Arogonavti (AGO1, AGO2, AGO3), DICER-2 ter različni dsRBP (double stranded RNA binding proteins). Za njegovo aktivno delovanje pa so potrebni Mg2+ ioni. Koliko komponent pravzaprav sestavlja RISC še ni znano. Mnogi znanstveniki trdijo, da so zgoraj našteti proteini osnovne komponente kompleksa, a vendar vseeno mislijo, da te niso edine, ki sodelujejo pri procesih, ki jih vrši RISC. Po njihovem mnenju obstajajo še določeni regulatorni proteini, ki se vežejo s kompleksom RISC, a vendar njihova funkcija in zgradba še ni pojasnjena. Je pa v letih raziskovanja kompleksa RISC znanstvenikom uspelo razrešiti funkcijo in strukturo proteinov iz družine Argonavti. AGO1 je 169 aminoklislinskih ostankov dolg protein, katerega glavna domena je bila identificirana kot PAZ domena. Prisotnost PAZ domene so odkrili tudi v proteinu AGO2 ter pokazali, da gre za 124 aminoklislinskih ostankov dolg protein.
Vloga kompleksa RISC
Osnovni princip delovanja kompleksa RISC temelji na vezavi bodisi miRNA (mikro interference RNA) ali siRNA (small interference RNA), ki nosita regije komplemetarne tistim na mRNA molekuli. Vezava mRNA s kompleksom povzroči njen razpad, ter s tem izgubo funkcionalnosti, kar se posledično izrazi z utišanjem specifičnega gena. Procesa delovanja kompleksa RISC dolga leta znanstveniki niso v celoti razumeli. Niso namreč znali pojasniti terminacije procesa. Drugače rečeno, niso znali obrazložiti kaj ter kako v RISCU povzroči razpad mRNA molekule. Prvi potrjen mehanizem delovanja kompleksa je bil predstavljen s strani Hannona in sodelavcev leta 2000. To je bil prvi mehanizem, ki je ponujal razlago terminacijske točke v delovanju RISC kompleksa.
Mehanizem delovanja kompleksa RISC skozi leta odkrivanja
Začetki odkrivanja in razvoj mehanizmov
Gregory Hannon in sodelavci so leta 2000 odkrili encim prve stopnje utišanja genov – DICER. Njim pa gre tudi zasluga za odkritje zgoraj omenjenega kompleksa RISC. Prvič so Hannon in sodelavci opazili RISC v sadni muhi (Drosophila melanogaster), nadaljnje raziskave pa so bile narejene na Caenorhabditis elegans ter v končni fazi tudi na človeških celicah. Od leta 2000 do danes je bilo predlaganih veliko mehanizmov delovanja, a vendar celotna zgodba še vedno ni popolnoma pojasnjena. Kakorkoli že, danes sta splošno v veljavi dva potrjena mehanizma in sicer: RISC vezavni model ter SLICER model.
Uveljavljeni mehanizmi delovanja kompleksa RISC
V sledečem delu besedila bo opis delovanja mehanizma zaradi lažjega razumevanja temeljil zgolj na siRNA. Potrebno pa se je zavedati, da kompleks RISC deluje tudi na miRNA, ter še nekatere druge oblike RNA molekul.
RISC-vezavni model
SiRNA se v kompleksu RISC veže na proteine DICER2, R2D2 in nekatere dsRBP, ter s tem aktivira kompleks. Enkrat, ko je kompleks aktiviran se lahko začne odvijanje dvojne vijačnice siRNA molekule. Na tej točki je pomembno omeniti to, da ni znano kateri protein kompleksa RISC ima točno helikazno aktivnost in vrši ločevanje verig. Teorija RISC-vezavnega modela predstavlja, da naj bi bil to eden izmed še ne identificiranih proteinov kompleksa RISC. Ko je separacija verig siRNA končana, se protismiselna (ang. antisense) veriga veže na protein iz družine Argonavtov, najpogosteje AGO2. Smiselna (ang. sense) veriga siRNA pa se ne veže v kompleks, ampak se po ločitvi verig razgradi v citoplazmi. Mehanizem kompleksa RISC ima poseben mehanizem za prepoznavanje protismiselne verige. Gre namreč za to, da je smiselna veriga termodinamsko bolj stabilna, kar zazna protein R2D2, ki se nanjo tudi veže. Vezan RD2D deluje kot neke vrste signal za odstranitev smiselne verige.
SLICER model
Pri drugem predlaganem mehanizmu (SLICER model) poteče enak proces označitve protismiselne verige. Razlika tega modela v primerjavi s prvim je samo v tem, da pri tem modelu trdijo, da je AGO2 tisti, ki naj bi verigi ločil. Pri tem modelu je v nasprotju s prejšnim, siRNA že od začetka vezana na AGO2.
Mehanizem vezave mRNA v kompleks RISC
Pri obeh modelih ostaja protismiselna veriga siRNA vezana na AGO2. Na to verigo se lahko s komplemetarnimi bazami veže molekula mRNA. Nekatere raziskave potrjujejo, da ni nujno, da se molekula mRNA veže s popolnim ujemanjem baznih parov, medtem ko druge trdijo da mora biti to ujamanje nujno popolno, ker drugače nadaljni procesi ne stečejo. Do leta 2004 niso popolnoma razumeli zakaj se geni zapisani v mRNA ne izražajo po tem, ko je tudi mRNA vezana v kompleks RISC. Nato pa so Dianne S. Schwar in sodelavci pokazali, da ima RISC endonukleazno aktivnost, ter tudi, da le-ta zavisi od Mg2+ ionov. Po tem odkritju je postalo jasno, da po tem, ko se mRNA veže z siRNA RISC, deluje v smer njene cepitve in posledičnega uničenja. S tem se seveda »izgubijo« tudi geni katere kodira. Kasnejše raziskave pa so pokazale, da ni nujno, da RISC utiša gene popolnoma, ampak jih lahko utiša tudi samo za nek časovni interval. Do tega pride v tako imenovanih GW telescih oziroma citoplazemskih (P) faktorjih. Tam se poleg mnogih encimov (decapping proteini, deadenilaze, endonukleaze…) nahaja tudi RISC. Za ta telesca je značilno, da lahko mRNA razgradijo ali pa jo ohranijo v mirujoči fazi. Če je mRNA ohranjena, se lahko potem po potrebi iz teh telesc tudi sprošča. Na ta način je sicer reguliranjih malo mRNA, a vendar je tudi taka regulacija mogoča.
Kompleks RISC v odvisnosti od molekule ATP
Do neskladnosti delovanja kompleksa RISC prihaja tudi v smislu porabe ATPja. Predlaganih je kar nekaj teorij, vendar do danes nobena ni popolnoma sprejeta ali ovržena, tako da je celoten mehanizem delovanja kompleksa RISC tudi iz tega stališča še neznan. V začetkih raziskovanja (od 2000 so približno 2004) so trdili, da je za odvijanje dvojne vijačnice siRNA molekul poleg helikazne aktivnosti specifičnih komponent potrebna tudi energija v obliki ATP. Nadaljnje raziskave pa so pokazale, da je ATP potreben za vezavo siRNA na kompleks RISC, medtem ko naj bi bilo razvijanje vijačnice siRNA popolnoma pasiven proces, uravnavan s proteini: DICER-2 TRBP ter AGO1 oziroma AGO2.
Kompleks RISC ostaja neraziskan
Centralni problem v razumevanju delovanja kompleksa RISC na biokemijskem nivoju je predvsem ta, da je mnogo komponent tega kompleksa še neznanih. Za enkrat so v smislu zgradbe in delovanja znani samo proteini Dicer-2, Ago-2 ter nekateri dsRBPs. Zaradi tega ne moramo z gotovostjo trditi kako RISC pravzaprav deluje. Lahko pa trdimo, da bi bilo popolno odkritje principa delovanja prav gotovo velikega pomena, ne samo iz vidika razumevanja samega temveč tudi zaradi morebitne aplikacije v medicino.
Viri in literatura
Tomari, Y. Biochemical dissection of RISC assembly and function. Nucleic Acids Sympossium Series, 2009, letn. 53, str. 15.
Tomari,, Y., Du, T., Zamore D., P. Sorting of Drosophila Small Silencing RNAs. Cell, 2007, letn.130, str. 299-308.
Gregory, R., Chendrimada, T., Cooh, N., Shiekhatta, R. Human RISC Couples MicroRNA Biogenesis and Posttranscriptional Gene Silencing. Cell, 2005, letn. 123, str. 631-640.
Paroo, Z.,Liu, Q. and Wang, X. Biochemical mechanisms of the RNA-induced silencing complex, Cell research, 2007, letn. 17, str. 187–194.
Hannon J., G. RNA interference, Nature, 2002, letn. 418, str. 244-251.
Schwarz S., D., Tomari, Y. Zamore D., P. The RNA-Induced Silencing ComplexIs a Mg2+Dependent Endonuclease. Current Biology, 2004, letn. 14, str. 787–797.
Gredell A., J. Kini K., H, Walton, P. Engineering cell function by RNA interference. Deptartment of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan, USA. [citirano 30. 03. 20012] http://www.egr.msu.edu/abel/GredellChapter.pdf
