Epigenetsko reprogramiranje celic

Včasih je veljalo, da se celica, ko je enkrat diferencirana, ne more več spremeniti v noben drug tip celice. Vsaka od teh tipov diferenciranih celic (celična populacija) ima točno določen značilen epigenetski profil, ki ga določajo vse epigenetske spremembe, teh pa se naj ne bi dalo spreminjati. Ta teorija je bila ovržena, ko sta J.B. Gurdon in S. Yamanaki leta 2006 dokazala, da diferencirane somatske celice lahko spremenimo nazaj v pluripotentne matične celice, za kar sta leta 2012 dobila tudi Nobelovo nagrado za medicino.

Epigenetsko ali celično reprogramiranje je zapleten proces, pri katerem zaradi epigenetskih sprememb pride do spremembe celičnega tipa. Gre za spremembo epigenetskega in ne genetskega materiala. Ta proces je lahko naraven ali umetno voden. Naravno poteka pri nastanku gamet in po oploditvi jajčeca ter je namenjeno izbrisu epigenetskih modifikacij, ki bi jih osebek lahko podedoval od obeh gamet. Z umetno vodenimi procesi sta začela Briggs in King leta 1952, ki sta dokazala, da je diferencirani celici možno povrniti sposobnost tvorbe blastule (kloniranje). Nove prelomnice v epigenetskem reprogramiranju so bile reprogramiranje odrasle sesalske celice v pluripotentno stanje in kloniranje ovce Dolly (Wilmut in Campbell, 1997), fuzija diferenciranih celic s pluripotentnimi celicami (Takahashi in Yamanaka, 2006), transdiferenciacija humanih fibroblastov v nevrone (Vierbuchen in sod., 2010) in v celice krvi (Szabo in sod. 2010).

Epigenetske modifikacije

Epigenetske spremembe so kovalentne modifikacije, ki potekajo na DNA in histonih. Povzročajo drugačno zvitje kromatina, dovoljujejo ali preprečujejo vezavo proteinov na DNA, ter tako dovolijo transkripcijo ali utišajo gen. Na njih poleg dednosti vplivajo tudi drugi dejavniki, kot so naše prehranjevalne navade, vpliv okolja in izpostavljenost onesnaženju.

Metilacija DNA

Metilacija DNA je kovalentna modifikacija, kjer se metilna skupina veže na citozinski ostanek, pri čemer nastane 5'-metil citozin. Zaradi večje učinkovitosti metilirane citozinske ostanke po navadi najdemo v kupinah, kjer povzročijo, da se transkripcijski faktor ne more vezati na prepoznavno mesto DNA. S tem se posledično ustavi ekspresija določenega gena. Poznamo dva tipa metilacije, vzdrževalno in de novo metilacijo. Naloga prve je ohranjanje metilacije med replikacijo (epigenetsko dedovanje), naloga druge pa dodajanje metilne skupine na nove citozine in s tem spreminanje epigenetskih lastnosti osebka.

Posttranslacijske modifikacije histonov

Posttranslacijske modifikacije (PTM) histonov so drug tip epigenetskih sprememb. Pri tem encimi in na njih vezani proteini povzročijo kovalentne modifikacije na histonih (po navadi na podenotah H3, H4 in H2B). Tako na histonih potekajo metilacija, fosforilacija, ubikvitinacija ter najpogostejši, acetilacija in deacetilacija. Vse te modifikacije pa ne ustavijo/aktivirajo ekspresije genov direktno (tako kot metilacija DNA), temveč povzročijo, da se DNA še bolj zategne/sprosti okoli histona – odvisno od vrste modifikacije. Možne so različne kombinacije PTM na histonih. Vsaka od teh kombinacij modifikacij ima drugačen vpliv na ekspresijo genov. Acetilacija poteka s pomočjo histonske acetiltransferaze (HAT) na lizinskih ostankih in povzroči ali ekspresijo nekega gena ali pa histonsko odlaganje, deacetilacija pa s pomočjo histonske deacetilaze (HDAC) povzroči inaktivacijo gena. Metilacija povzroči rezanje genov, fosforilacija mitozo ali mejozo, kombinacija fosforilacije in acetilacije na točno določenih mestih pa povzroča ekspresijo genov.

Celice in njihova diferenciacija

Celice delimo glede na stopnjo diferenciacije na totipotentne (sposobnost tvorbe vseh celic organizma; npr. zigota), pluripotentne (sposobnost diferenciacije v vse tri zarodne plasti – mezoderm, ektoderm, endoderm; npr. embrionalne matične celice), multipotentne (sposobnost diferenciacije v različne tipe celic, vendar ne v vse; npr. odrasle matične celice različnih tkiv) in unipotentne (tvorba samo enega tipa celic; npr. matične celice testisov). iPs celice oz. iPSCs so zarodne pluripotentne celice, ki so bile umetno ustvarjene iz ne pluripotentnih celic. Po navadi je to odrasla somatska celica, ki ima »prisiljeno« ekspresijo določenih genov. Te celice imajo veliko podobnosti z naravnimi zarodnimi pluripotentnimi celicami (ekspresija določenih genov, metilacija kromatina, formacija zarodne celice,...). Poln obseg njihove zveze z naravnimi pluripotentnimi zarodnimi celicami še vedno ni znan. Inducirane pluripotentne celice so bile do sedaj narejene iz odraslih želodčnih, jetrnih, ledvičnih, epitelijskih in krvnih celic.

Metode celičnega reprogramiranja

Epigenetsko reprogramiranje je širok pojem, ki vsebuje dve vrsti diferenciacije. Dediferenciacija je sprememba dokončno diferenciranih celic v manj diferencirane celice (pluripotentne). Pri transdiferenciaciji pa gre za neposredno spremembo iz enega diferenciranega celičnega tipa v drug diferenciran celični tip.

Metode dediferenciacije celic v toti- ali pluripotentno stanje so različne. V primeru toitpotentnih celic je reprogramiranje posredovano preko zrele jajčne celice v metafazi II, kot prenos jedra somatske celice (Wilmut in sod., 1997). Nedavno so odkrili in prikazali izvedljivost celice (zgodnjega blastomera), ki so jo med mitozo kemijsko oslabili, pri čemer so uničili jedrno ovojnico za nadaljnje reprogramiranje v totipotentno celico, v procesu kromosomskega prenosa (Egli in Eggan, 2010).

Trenutne strategije za reprogramiranje celice v pluripotentno stanje:

1. Transplantacija jedra somatskih celic v neoplojeno oocito (kloniranje).
2. Fuzija somatskih celic z ESC (embrionalne somatske celice) se pokaže kot zanimiva metoda, saj nastanejo tetraploidne hibridne celice.
3. Prehodna inkubacija somatskih celic z ekstrakti ESC vzpodbudi določene jedrne odzive in promovira reprogramiranje celice v pluripotentno.
4. Retrovirusna transdukcija ESC transkripcijskih faktorjev Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc je dovolj, da stimulira pretvorbo fibroblastov v pluripotentno stanje, kot ga imamo pri zarodni celici. Ustvarimo torej inducirane pluripotentne zarodne celice (iPS). Primer dediferenciacije odraslega človeškega fibroblasta, ki jo lahko ustvarimo z uporabo štirih faktorjev: Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Med njimi sta Oct3/4 in Sox2 ključna transkripcijska faktorja, C-Myc in Klf4 pa vplivata na strukturo kromatina, da se Oct3/4 in Sox2 lahko vežeta. Faktorje v celico vnesemo z retrovirusom (pLenti6/UbC-Slc7a1, lentivirus – družina HIV, SIV, FIV), v kasnejših stadijih poskusa dobimo iPS celice (induced pluripotent stem cells). Lastnosti teh celic niso odvisne od kontinuiranega izražanja transgenov, ampak so reprogramirane (Takahashi et al. 2007). Zaradi retrovirusnih vključkov je tumorigenost iPS celice povečana in je potrebno iskati nove ne-virusne metode vnosa faktorjev v celico.
5. Metoda virusne transdukcije se lahko izvede tudi na drugačen način. Ta način odločno podpira dediferenciacijo celice v pluripotentno stanje preko retrovirusne ali DNA-virusne poti. Pri tem je možna insercijska inaktivacija. Poleg tega je bilo tudi dokazano, da epigenetsko reprogramiranje s prisiljeno ekspresijo genov na plazmidu OSKM obstaja in sicer, kot konstrukt (plazmid DNA), ki je povezan s homologno rekombinacijo. Te metode niso organizmu prijazne, saj lahko potencialno spremenijo gostiteljev genom z insercijo gena (Ho in sod., 2010).
6. Transdukcija preko proteinov (protein-mediated transduction), ki lahko celice reprogramira tako, da postanejo pluripotentne. Metoda je sicer okorna saj zahteva ekspresijo rekombinantnih proteinov ter znanje o čiščenju proteinov. Reprogramiranje celice pa je možno tudi pri zelo nizkih frekvencah (Kim in sod., 2009)

Glavni cilj metod za reprogramiranje je kovalentna vezava manjših molekul, ki so glavni akterji pri reprogramiranju celice. Noben koktail snovi, ki so jih vstavili v celico ni bil popolnoma uspešen pri popolnem reprogramiranju celice. Obstaja veliko zgoraj omenjenih poskusov, ki dokazujejo, da ti procesi resnično delujejo. Prav zato lahko v prihodnosti pričakujemo še veliko novosti na tem področju.

Viri

• Rožman P., Pridobivanje EMC brez uničenja zarodka(http://www.ztm.si/res/doc/EMC%20-%20alternative-3246.pdf); (27.5.2013)

• Ferro S., Cloned Human Embryo Study Comes Under Fire (http://www.popsci.com/science/article/2013-05/cloned-human-embryo-paper-comes-under-fire); (27.5.2013)

• Rački N., Diplomsko delo: Izdelava poročevalnega vektorja z dvema poročevalcema za spremljanje izražanja izbranega gena v celičnih kulturah (http://www.digitalna-knjiznica.bf.uni-lj.si/dn_racki_nejc.pdf); (27.5.2013)

• Reprogramming (http://en.wikipedia.org/wiki/Reprogramming); (27.5.2013)

• Induced pluripotent stem cell (http://en.wikipedia.org/wiki/Induced_pluripotent_stem_cells); (27.5.2013)

Zunanje povezave

• Posnetek na youtube-u: Epigenetics in NOVA SCIENCE (http://www.youtube.com/watch?v=7WEHoCA1hpo); (27.5.2013)