Uporaba iPSC za zdravljenje anemije srpastih celic pri miših

1 Uvod

Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna motnja do katere pride zaradi zamenjave adenina s timinom na šestem kodonu človeškega gena za β-globin. Posledica zamenjave je pretvorba hidrofilnega glutamata (HbA) v hidrofobni valin (HbS). Nadomestitev glutamata z valinom zmanjša topnost in povzroči agregacijo, kar privede do številnih sprememb v eritrocitih. HbS povzroči rigidnost in nezmožnost prileganja levkocitom, endotelijskim celicam in trombocitom kar lahko pride do zamašitve majhnih kapilar. Na drugi strani HbS polimerizacija povzroči krhkost, hemolizo eritrocitov, prost hemoglobin lahko povzroči poškodovano tkivo, kap, odpoved ledvic, motnje v delovanju ledvic in hude bolečine. Uspešno in vitro reprogramiranje mišjih in človeških fibroblastov v pluripotentne zarodne celice (iPS) z retrovirusno trandukcijo s štirimi transkripcijskimi faktorji (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) podaja terapevtski potencial za zdravljenje ljudi z genetsko napako v hematopoetičnem sistemu. To so dosegli z reaktivacijo endogenih pluripotentnih genov Oct4 in Nanog. iPS celice, ki so nastale iz človeških ali mišjih fibroblastov so po genetskih, epigenetskih in razvojnih lastnostih zelo podobme embrionalnim zarodnim celicam (ES celice). Uporabnost iPS celic v dolgoročne terapevtske namene zdravljenja odraslih bolnikov pogojuje in vitro uspešnost nastanka hematopoetičnih celic iz iPS celic. Zdravljenje zahteva (1) reprogramiranje mutiranih fibroblastov v iPS celice, (2) popravo genetske napake s homologno rekombinacijo, (3) in vitro diferenciacijo popravljenih iPS celic v HP in (4) prenos teh celic v miši.

2 Homologna rekombinacija

Zamenjava srpastega gena za globin βS s človeškim βA genom s homologno rekombinacijo obide problem, ki nastane pri transdukciji hematopoetičnih zarodnih celic z lentivirusnimi vektorji, ki vsebujejo gene proti srpasti obliki celic. Čeprav se lentivirusi samostojno inaktivirajo obstaja možnost insercijske mutageneze, to pa inhibira tumor-supresorske gene in aktivira onkogene, kar lahko privede do levkemije. Plazmid (24kb) s človeškim Aγ genom za globin (383bp) na 5' flanking sekvenci in s človeškim βA genom za globin (815bp) na 5' flanking sekvenci je bil razrezan s SalI in nastal je -383 γ-βA DNA fragment. -383 γ-βA DNA konstrukt so z elektroporacijo vstavili v »knock-in« srpaste embrionalne zarodne celice (hα/hα, -1400 γ-βS/-1400 γ-βS ). Te celice so nanesli na embrionalne fibroblaste, ki so jih predhodno obdelali z mitomycinom C, ki deluje kot kemoterapevtik. Gojili so jih na selekcijskih gojiščih z antibiotikom hygromycin in gancyclovir. DNA so izolirali iz posameznih kolonij embrionalnih zarodnih celic in jo analizirali s PCR. Homologne rekombinante so identificirali s primerji za identifikacijo pravilne 5’ sekvence, 3’ sekvence ter s primerji za razlikovanje med βA in βB aleli. Z zamenjavo mišjega α-globin gena s človeškim α-globin genom (hα/hα) in z zamenjavo mišjega β-globin gena s človeškim Aγ- in βS-globin genom (-1400 γ-βS/-1400 γ-βS) so naredili »knock-in« model miši za raziskovanje anemije srpastih celic.

3 Rezultati homologne rekombinacije

V izvornem članku so raziskave izvajali na iPS celicah, opirali pa so se na enega izmed nekoliko mlajših poskusov, kjer so enak postopek izvedli na zarodnih embrionalnih celicah. Z uporabo tehnike homologne rekombinacije ter s pomočjo elektroporacije so -383 γ-βS DNA konstrukt vstavili v knock-in srpaste embrionalne zarodne celice, le-te pa so nato dva tedna rasle na posebnem gojišču, ki je vsebovalo hygromicin in gancyclovir. Nato je sledila PCR analiza DNA, na gojišču zraslih kolonij. Določili so, kje je bila rekombinacija uspešna oz. kje se je βS globin gen uspešno zamenjal z βA-globin genom. S posebnimi primerji so poiskali homologne rekombinante, za uspešno ločitev med βA in βB aleli pa so pri PCR uporabili še restriktazo Bsu36I, ki je sposobna rezati le βA; βB pa ne more. Himerne moške celice pridobljene iz blastocist so združili z ženskimi celicami (homozigote za človeški α-globin gen) in pri mladičih ponovno poiskali uspešno popravljene genotipe. Na koncu razsikave je sledila analiza uspešno popravljenih genotipov. Ugotovili so, da živali, ki so bile zdravljene, kažejo le še malo oz. ne kažejo več bolezenskih znakov, kar nakazuje, da je visok nivo HbA, ki ga zdravljene celice zato ponovno začnejo sintetizirati, zadovoljiv za zdravljenje anemije. Opaziti je mogoče tudi velike spremembe v morfolgiji celic, saj krvni razmaz zdravljenih miši ne vsebuje več togih, podaljšanih celic (krvni razmaz, značilen za bolne miši), temveč se skorajda ne razlikuje od kontrolnega razmaza zdrave miši. Dobljeni rezultati mnogo obetajo in nakazujejo, da bi v prihodnosti lahko s pomočjo homologne rekombinacije zdravili anemijo srpastih eritrocitov in njej podobne bolezni. Uporabljena tehnika je še posebej primerna zato, ker se tako izognemo naključnim insercijam in zmanjšamo tveganje za mutagenezo (le-ta je posledica naključne insercije ene ali več kopij virusnega vektorja v veliko število celic).

4 Diferenciacija iPS v HP celice

Homologni rekombinaciji je sledila in vitro diferenciacija iPS v hematopoetične prekurzorske celice (HP); predhodnike hematopoetičnih matičnih celic, iz katerih se nadaljuje razvoj krvnih celic po specifičnih celičnih linijah. Prepoznamo jih po izraženju različnih markerjev, npr.: CD45, Sca-1, CD41, Runx1. Med zgodnjimi znaki hematopoeze je predvsem c-kit antigen, pojavijo pa se tudi prve delitve HP celic na celične linije, kar nakazujejo eritroidni in mieloidni markerji. Izraženje omenjenih znakov je bilo ključno za prepoznavo ustreznosti postopka diferenciacije. Zaradi velike podobnosti med ES in iPS, so bile metode za razvoj embrionalnih matičnih celic (ES) v HP celice uporabljene na popravljenih iPS. Na izbranih linijah je bila inducirana ekspresija HoxB4 gena. HoxB4 spada v skupino homeotičnih selektivnostnih genov. Ti med drugim zapisujejo za t.i. Homeobox proteine, ki delujejo kot transkripcijski faktorji. Izraženje gena HoxB4 poveča efektivnost diferenciacije. V raziskavi je bil HoxB4 (označen z GFP kot markerjem) vnešen v celice z Moloney retrovirusom. Kot kontrola so bile uporabljene ES celice. Glede na enakovredno raziskavo, citirano v članku, bi retrovirusni vnos morda neugodno vplival na diferenciacijo. Zato se lahko ekspresijo gena inducira z uvedbo tetraciklin-vzbuditvenega HoxB4 transgena. Tetraciklin je antibiotik, ki vpliva na promotorsko aktivnost, pogosto pa se uporablja njegov analog doksiciklin. Tetraciklinski promotorski sistemi temeljijo na interakciji med tetraciklinskim transaktivatorjem (tTA) in tetraciklinskim odzivnim elementom (TRE). Ko tetraciklin ni prisoten, je TRE vezan na tTA in transkripcija poteka. Ko tTA ne more vezati TRE, se ekspresija ustavi. Reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA), pa obratno TRE veže le ob prisotnosti tetraciklina. rtTA, v celice vnešen s homologno rekombinacijo, aktiviramo z doksiciklinom, kar sproži ekspresijo HoxB4 gena.

Diferenciacija zahteva sodelovanje faktorjev kot so manjše RNA molekule, transkripcijski in rastni faktorji ter dodatne molekule, katere navadno izločajo sosednje celice. Za potek hematopoeze, je potrebno tako zagotoviti ustrezne pogoje. Primerno je gojenje iPS ali ES celic na OP9 stromalni celični liniji kostnega mozga. Za popolnejšo pretvorbo v HP celice pa je ključen dodatek primernega nabora citokinov. V začetnih fazah diferenciacije iz matičnih celic so pomembnejši citokini SCF, FL in LIF. SCF je ligand membranskega receptorja c-kit antigen. Hematopoetični citokini z vezavo na membranske receptorje sprožijo kaskado reakcij, katere končni rezultat je de/aktivacija transkripcijskih faktorjev hematopoeze. Med pomembnejše transkripcijske faktorje sodijo: GATA-2, SCL, LMO2 in AML-1. Z ekspresijo HoxB4 gena ter gojenjem izbranih iPS celičnih linij na OP9 stromi z dodanimi citokini, so bile iPS celice uspešno in vitro diferenciirane v HP celice. To je bilo potrjeno z analizo izraženih CD41, c-kit antigena ter mieloidnih in eritroidnih markerjev. Razvile so se tako nezrele kot zrele mieloidne kolonije. HP celice so bile transplantirane v odrasle recipientske miši obolele z anemijo srpastih eritrocitov.

5 Rezultati

Pri homologni rekombinaciji je prišlo do uspešne zamenjave hβS s hβA pri eni od 72 kolonij, ki so bile odporne na hygromycin in gancyclovir. Rezultati kažejo, da je uspešnost popravljanja iPS celic s homologno rekombinacijo primerljiva s homologno rekombinacijo embrionalnih celic. Ocenili so še ali so in vitro pridobljene HP celice zmožne obnoviti hematopoetični sistem miši s srpasto anemijo in popraviti fenotip. Analiza rezultatov in uspešnost postopka sta bili spremljani s pomočjo GFP označenega HoxB4 proteina. Vnos popravljenih iPS celic v tri poskusne HβS/hβS miši se je izkazal za uspešnega. V miših so po 20 dnevih prevladovale mieloidne kolonije, ki so izvirale iz transplantiranih HP celic, z GFP označene celice pa so ostale v perifernem krvnem obtoku tudi do 12 tednov po transplantaciji. PCR analiza je pokazala, da ima DNA iz periferne krvi zdravljene miši značilnosti hβA in hβA alelov, ki jih DNA iz kontrolne hβS/ hβS ni imela. Elektroforeza človeških HbA in HbS iz krvi nezdravljene in zdravljene hβs/hβs miši je pokazala funkcionalne spremembe srpastih celic. Po 4 – 8 tednih po transplantaciji so izmerili 65% več HbA in izrazito zmanjšanje HbS proteina v krvi zdravljene miši. V krvnem razmazu nezdravljenih hβs/hβs miši so poleg srpastih celic prisotne retikulocite. Te so znak povišanega nastanka eritrocitov, ki premagujejo kronično izgubo eritrocitov. Po kostni transplantaciji se je zmanjšalo število nenormalno oblikovanih krvničk in retikulocit. Pri zdravljenih hβs/hβs miših se je izboljšalo tudi splošno stanje, ki je bilo posledica izgube teže in pospešenega dihanja. Miši, ki so jim transplantirali iPS celice niso kazale znakov tvorjenja tumorjev, čeprav ste ti lahko kasneje še razvijejo.

6 Zaključek

Zdravljenje anemije srpastih celic z iPS celicami je obetavno ker: (1) ni potrebe po imunosupresivnih zdravilih za preprečitev zavračanja transplantiranih celic, (2) pri zdravljenju s homologno rekombinacijo ne pride do imunskega zavračanja celic in (3) se ponujajo terapevtske možnosti diferenciacije iPS celic v katerokoli obliko celice. Čeprav so uspešno reprogramirali človeške iPS celice je za zdravljenje z iPC celicami potrebno poiskati faktorje za reprogramiranje, ki niso onkogeni, opustiti prenos genov z retrovirusnimi vektorji, ki lahko povzročajo mutagenezo in sestaviti točen protokol za človeške iPS celice.