User:TomazRozmaric
Uvod
Odkritje induciranih pluripotentnih celic so nam omogočile tehnike in znanstvena načela ki so bila odkrita v 2. Polovici 20. Stoletja. V tem obdobju je so se dovolj izpopolnile tehike ločevanja, vzgajanja in preučevanja celic, s prenosom somatskega jedra je bilo dokazano, da diferencirane celice ohranijo enak genetski material kot embrionalne zarodne celice in prišli smo do spozananja, da so transkripcijski faktorji ključnega pomena za diferenciacijo celic.
Raziskava
Leta 2005 je potekala raziskava v kateri so preverjali alternativno možnost za reprogramiranje somatskih celic v celice embrionalnega značaja. Do takrat je bilo že znano, da je citoplazma oocite zmožna reprogramirati genom somatske celice v embrionalno stanje, v novi metodi pa bi namesto oocit vlogo reprogramerja igrale človeške zarodne celice. Vlaganje truda v razumevanje procesov, ki potekajo med reprogramiranjnem ima veliko perspektivnih aplikacij v bodočni medicini in raziskavah. Dobro poznavanje mehanizmov nam bi namreč omogočilo izdelavo genetsko prirejenih celičnih linij za nove študije in zdravljenje bolezni.
Raziskava na podlagi predhodnih eksperimentov na mišjih zarodnih celicah predvideva, da so človeške zarodne celice dober kandidat za reprogramiranje somatskih celic. Poslužili so se metode kjer s polietilen glikolom (PEG) spojijo membrane človeških fibroblastov in zarodnih celic (hES). Ker fuzija s PEG ni zelo učinkovita so s transfekcijo pripravili proti higromicinu odporne in GFP pozitivne hES, s transdukcijo pa proti purimicinu odporne fibroblaste. Tako pripravljeni kulturi so zmešali, dodali PEG in jih na gojišču za hES izpostvili dvojni selekciji (prisotnost purimicina in higromicina). Na ta način je bilo poskrbljeno, da so v kulturi le celice, ki so se uspešno spojile.
Za dodaten dokaz ,da so na antibiotike odporne celice res nastale s fuzijo obeh tipov celic so primerjali fluorescenco hES in hibridnih celic ter izvedli PCR na hibridnih celicah. Rezultati so pokazali, da je fluorescenca v hibridnih celicah prisotna v enaki meri kot v hES ter, da hibridne celice vsebujejo viralni vektor ki so ga vnesli v celice fibroblasta.
V nadaljevanju je bilo potrebno odgovoriti na vprašanje, če se je somatski genom po fuziji res reprogramiral. Opazovanja rasti celic, njihovega celičnega cikla, celične delitve, transkripcijskih faktorjev in antigenov, so pokazala da hibridne celice izražajo vse lastnosti hES. Hibridne celice so izražale transkripcijske faktorje kot je OCT4, ki je specifičen za zarodne celice, zaznana je bila telomerazna aktivnost, izraženi so bili embrionalno specifični antigeni (SSEA4, TRA1-61,TRA1-80) in opažena je bila nesmrtna rast celic.
V primeru uspešnega reprogramiranja somatskega jedra bi morale biti hibridne celice pluripotentne. V raziskavi so pluripotentnost hibridnih celic opazovali in vivo in in vitro. V primeru in vitro testiranja, kjer so bile hES in hibridne celice kulturirane v suspenziji, je v obeh primerih prišlo do tvorbe embrionalnih telesc. Tudi pri in vivo testu je bil rezultat za obe skupini celic enak. Po injiciranju celic v golo miš je prišlo do tvorbe teratomov v katerih so bili izraženi proteinski produkti značilni za posamezne zarodne plasti; beta3- tubulin (neuroectoderm), miosin (mesoderm), alfa-fetoprotein (endoderm).
Za prevrjanje če so se embrionalni geni v hibridnih celicah reaktivirali so uporabili transgeni reporter, v katerem je bilo izražanje GFP odvisno od promotorskih regij Rex-1 gena. Rex-1 je specifičen protein za zarodne celice. Reporter je bil aktiven, ko je bil transficiran v hES in neaktivn ko je bil vnešen v celice fibroblasta. Celice fibroblasta ki so vsebovale reporter so nato spojili s hES, ki niso nosile gena za GFP. Nastale hibridne cleice so izražale GFP v enaakih koncentracijah kot hES, kar kaže na to da so se embrionalni geni reaktivirali.
Genski produkt CRIPTO/TDGF1 je komponenta NODAL signalne poti in se izraža samo v hES. V raziskavi je bil opažen fibroblastno secifičen polimorfizem na enem nukleotidu neprepisanega CRIPTO/TDGF1 gena. V raziskavi je bilo opaženo, da je bil fibroblastno specifičen polimorfizem prisoten tudi v treh od devetih izoliranih DNA hibridnih celic. To odkritje nakazuje na to, da so bili somatski aleli tega gena aktivirani po fuziji hES s fibroblasti, vendar aktivacija ni potekla 100%.
Za ugotovitev ali je v hibridnih celicah prevladovalo embrionalno transripcijsko stanje ali je bilo morda izraženo tudi somatsko transkripcijsko stanje, so v raziskavi uporabili metodo genome wide transcriptional profiling . Končni rezultat je pokazal da je bilo več kot 99% analiziranih transkriptov reprogramiranih.
V raziskavi so opazovali tudi epigenetske spremembe pluripotentnih genov kot je OCT4. Ugotovili so da so CG dinukleotidi v regiji za OCT4 gen v primeru fibroblastov metilerani, pri hES pa demetilirani. Opažanja pri hibridnih celicah so pojazala da se njihova epigenetska struktura ne razlikuje od hES.
Za konec so v raziskavi ponovili eksperiment le, da so tokrat uporabili drugo linijo hES celic in namesto fibroblastov vzeli kostne celice. Rezultati eksperimenta so bili enaki kot v prvem delu, kar kaže na to, da zmožnost reprogramiranja hES ni omejena samo na eno linijo hES celic in eno vrsto somatskih celic.
Zaključek
Odkritja raziskave so pokazala da imajo hES celice zmožnost reprogramiranja somatskih celic v embrionalni značaj. Tako predstavljajo perspektivno zamenjavo za človeške oocite, kar bi močno pripomoglo k lažjemu raziskovanju mehanizmov reprogramiranja somatskih celic. Preden pa se bodo lahko hES uporabljele v terapeutske namene moramo ugotoviti kako se znebiti dodatnih kromosomov pred ali po fuziji celic. Če bi po enukleaciji hES obdržale reprogramske lastnosti, in če bi ugotovili kateri transkripcijski faktorji so pomembni da do reprogramiranja pride, potem bi se izognili nekaterim socialno etičnim problemom, ki se tičejo jedernega prenosa v človeške oocite.
