Predstavitev na ribosomih
Selekcija peptidov z visoko afiniteto vezave na SWCNT-je z uporabo metode predstavitve na ribosomih
Uvod
V članku z naslovom »In vitro selection of peptide aptamers with affinity to single-wall carbon nanotubes using a ribosome display« so Zha Li in sodelavci predstavili svojo raziskavo, v kateri so preučevali vezavo aptamernih peptidov na enoplastne ogljikove nanocevke (SWCNTs – Single-wall carbon nanotubes) s pomočjo metode predstavitve na ribosomih (ribosome display). Želeli so preučiti jakost vezave določenih peptidov na SWCNT-je s pomočjo omenjene metode in ugotoviti, kako njihova vezava vpliva na topnost teh nanocevk. Dobljeno topnost so primerjali s topnostjo SWCNT-jev, na katere so predhodno vezali organske surfaktante (površinsko aktivne snovi) ali peptide s pomočjo metode predstavitve na površni bakteriofagov (phage display).
Ogljikove nanocevke
Ogljikove nanocevke so alotropna modifikacija ogljika s cilindrično nanostrukturo. Ker je dandanes mogoče sintetizirati nanocevke z razmerjem dolžina-premer 100.000.000 : 1, imajo tako cevke premer 0,5-1,5 nm, dolge pa so lahko tudi do nekaj mm. Enoplastna ogljikova cevka (SWCNT) je zgrajena iz grafitne ravnine ogljikovih atomov (razporejenih v heksagonalno mrežo), ki jo zvijemo v cevko tako, da heksagonalne obroče spojimo koherentno. SWCNT-ji so zaradi svoje narave v vodnih raztopinah netopni, zato so znanstveniki v tej raziskavi želeli pridobiti ustrezne peptide s čim večjo afiniteto vezave na omenjene nanocevke, ki obenem tudi močno povečajo topnost le teh.
In vitro selekcija in iskanje aptemernih peptidov
Izbira metode in priprava zapisov za peptide
Avtorji članka so se odločili, da bodo v raziskavi uporabili metodo predstavitve peptidov na ribosomih zato, ker ima nekaj ključnih prednosti pred predstavitvijo na površini bakteriofagov (ni nepredvidljivih interakcij peptidov s površino bakteriofaga, problem bakterisjkih transformacijskih zahtev). Glede na to, da so v predhodnih raziskavah ugotovili, da ima pri vezavi peptida na nanocevke glavno vlogo triptofan (π-π tacking effect), so znanstveniki v raziskavi sintetizirali nukleotidna zaporedja, ki zapisujejo za 11 aminokislinskih ostankov in vsebujejo vsaj en triptofanski ostanek.
METODA PREDSTAVITVE PEPTIDOV NA RIBOSOMIH
V raziskavi so v in vitro pogojih pripravili knjižnico dsDNA z zapisi za različne peptide, izvedli transkripcijo, mRNA izolirali, nato pa v mešanico dodali ribosome, ki so začeli s translacijo. Tvoril se je kompleks mRNA-ribosom-peptid (ribosome complex), ki zaradi dejstva, da mRNA ni vsebovala stop kodona, ni razpadel takoj po prepisu peptida. Reakcijo so ustavili tako, da so mešanico postavili na led za 10 min, nato pa so jo inkubirali z očiščenimi SWCNT-ji v selekcijskem pufru eno uro pri 4 ºC. Pri teh pogojih so se ribosomski kompleksi s peptidi, ki so imeli visoko afiniteto za vezavo, vezali na SWCNT-je, kompleksi s peptidi z nizko afiniteto, pa so ostali prosti v raztopini. Po 5 minutnem centrifugiranjem pri 20.000xg so z izpiranjem odstranili nevezane komplekse in jih zavrgli, vezane pa raztopili v ustreznem pufru. Z uporabo EDTA, ki je povzročil razpad kompleksa, so pri sobni temperaturi ločili mRNA in jo izolirali s kompleti reagentov. Molekule mRNA so s pomočjo reverzne transkriptaze v procesu RT-PCR pretvorili v dsDNA in tako dobili nove (manjše) DNA knjižnice. Po šestih ciklih z vedno ostrejšimi pogoji so knjižnice, ki so vsebovale zapise za peptide z visoko afiniteto klonirali in jih analizirali.
Preverjanje topnosti solubiliziranih SWCNT-jev
Izbira peptidov z največjo afiniteto in solubilizacija SWCNT-jev
Iz množice peptidov so izbrali dva peptida, ki sta se v bakterijskih kolonijah najpogosteje nahajala: YFDLIWFAYSN (poimenovali so ga A1) in IFRLSWGTYFS (A2). Raztopini SWCNT-jev, ki so po naravi netopne molekule in v vodnih raztopinah percipitirajo, so dodali DMSO in jo homogenizirali. V posamezne homogenate so dodali raztopine peptidov A1, A2, P1 (peptid, preučen v predhodni raziskavi, zaporedje HWKHPSGAWDTL) ter raztopini SDS (natrijev dodecil-sulfat) in SC (natrijev holat). Raztopine so inkubirali čez noč, nato pa jih centrifugirali pri visokih vrtljajih, da so SWCNT-ji percipitirali. Supernatant, ki je vseboval proste peptide, SDS oziroma SC, so odstranili, percipitat pa ponovno raztopili. Novo nastala raztopina je tako vsebovala netopne SWCNT-je v percipitatu in topne v supernatantu. Odvzeli so približno 80% supernatanta in ga uporabili pri merjenju absorbance.
Merjenje absorbance in fluorescence raztopin – določitev zmožnosti solubilizacije posameznih peptidov
Z merjenjem intenzitet absorbance raztopin SWCNT-jev so ugotovili, da ima največjo zmožnost solubilizacije SWCNT-jev peptid A2, medtem ko A1 ni povečal topnosti ogljikovih nanocevk, P1 pa ni bil tako učinkovit. V nadaljevanju so primerjali še fluorescenci raztopin A2 in P1 s fluorescencami obeh raztopin z dodanimi SWCNT-ji. Ugotovili so, da je rahel premik spektralne črte pri dodatku SWCNT-jev v raztopino A2 posledica tesnejše vezave A2 peptidov na omenjene nanocevke, saj se mikrookolje pri tej vezavi bolj spremeni kot pri vezavi P1 peptidov. V zaključku raziskave so s pomočjo cirkularnega dikroizma (CD) ugotovili še, da se P1 peptid nahaja pretežno v naključni vijačni obliki, peptid A2 pa pretežno kot beta zavoj, ki je konformacijsko ugodnejši za vezavo.
Zaključek
Z vse hitrejšim razvojem bionanotehnologije tudi ogljikove nanocevke pridobivajo na svojem pomenu v biokemiji. Glede na njihovo netopnost v vodi je vsekakor ključnega pomena, da odkrijemo načine solubilizacije teh pomembnih molekul. Zato menim, da ima raziskava velik pomen za stroko, saj so v njej odkrili nove molekule za povečanje topnosti SWCNT-jev, obenem pa so dokazali, da je uporaba metode predstavitve na ribosomih z namenom selekcije peptidov vsekakor uspešna.
Članek
Z. Li, T. Uzawa, Y. Ito, E. Kobatake, T. Tanaka, H. Katakura, A. Hida, in K. Ishibashi, „In vitro selection of peptide aptamers with affinity to single-wall carbon nanotubes using a ribosome display“, Biotechnol. Lett., let 35, št 1, str 39–45, jan-2013.
