YTH s knjižnico celic HeLa

Interakcija proteina 14-3-3σ s proteinom KCMF1 zavira proliferacijo in nastajanje kolonij v humanih izvornih celicah raka na črevesju

UVOD Proteini iz družine14-3-3 so eni najštevilčnejših v celici in so zelo konzervativni. V človeški celici obstaja 7 izotipov, vsi imajo ključno vlogo pri mnogih regulatornih procesih v celici, kot so vzdrževanje kontrolnih točk in popravljanje DNA, preprečevanje apoptoze, spodbujanje celične diferenciacije, usmerjajo celično adhezijo in gibanje. Izmed 14-3-3 proteinov je izoforma 14-3-3σ najbolj neposredno povezana z rakom. Obstaja kar nekaj dokazov, da ima protein vlogo tumorskega supresorja, njegova inaktivacija olajša nastanek tumorja. Podrobnejše študije so pokazale, da je 14-3-3σ ključni regulator translacije med mitozo, prav tako ima vlogo pri zaključevanju mitoze in citokinezi. V predhodnih študijah raka na črevesju so ugotovili, da je v izvornih celicah raka ekspresija proteina veliko večja kot v diferenciranih celicah raka. Za boljše razumevanje vloge 14-3-3σ v tumorigenezi izvornih celic, so uporabili dvohibridni sistem kvasovk, s katerim bi našli nove proteine, ki z njim interagirajo.

DVOHIBRIDNI SISTEM

V študiji so za detekcijo interakcije uporabili protein kvasovke GAL 4, ki je transkripcijski faktor. GAL 4 sestavljata dve domeni, ena se veže na DNA (DNA-binding domain - DBD), druga pa deluje kot transkripcijski aktivator (activating domain - AD). Domeni se lahko izražata tudi kot ločeni peptidni verigi. Za GAL4 je značilno, da lahko obdrži funkcijo transaktivacije, četudi se njegovi domeni ne moreta povezati direktno med seboj- DBD in AD se povežeta preko dveh interagirajočih heterolognih proteinov, kar vodi v ekpresijo reporterskega gena.

KONSTRUKCIJA PLAZMIDA- VABE

Izolirali so človeške izvorne celice raka na črevesju in iz njih izolirali celotno RNA. Z RT-PCR so pomnožili gen 14-3-3σ, preverili njegovo sekvenco, nato pa so insert vstavili v ekspresijski plazmid pGBKT7 z zapisom za DBD. S plazmidom so transfecirali kvasovke seva AH109.

SCREENING HeLa cDNA KNJIŽNICE Z DVOHIBRIDNIM SISTEMOM KVASOVK

Po končani ekspresiji fuzijskega proteina 14-3-3σ- DNA-BD v kvasovki AH109, so izvedli metodo dvohibridnega sistema s HeLa cDNA knjižnico. Tako so poskušali najti proteine, ki interagirajo s proteinom 14-3-3σ. Iz humanih HeLa celic so izolirali totalno RNA, iz katere so z reverzno transkripcijo napravili cDNA knjižnico. Uporabili so pACT2 vektor, ki nosi zapis za AD, ter z njim transfecirali kasovke seva Y187. Kulturi kvasovk so parili, po nanosu na gojišče so zrastle modre kolonije, kar pomeni, da je 14-3-3σ inetragiral z neznanim proteinom iz HeLa. Iz pozitivnih kolonij so izolirali plazmide ter jih sekvencirali, da bi identificirali proteine. Ti proteini so bili: KCMF1, HIBADH in NQO2.

Za potrditev interakcij so ponovili metodo dvohibridnega sistema še v sesalskih celicah. S pozitivnimi rezultati so dokazali, da so interakcije med proteini v kvasovkah reproducibilne tudi v sesalskih celicah.

siRNA metoda

Da bi preverili delovanje kompleksa proteinov KCMF1 in 14-3-3σ v izvornih celicah raka na črevesju so uporabili metodo utišanja genov z siRNA. siRNA je 20-25 nukleotidov dolga dvoverižna RNA. Udeležena je na RNAi (interferenca RNA) poti, saj z vezavo na mRNA povzroči njeno razgradnjo na določenih mestih in s tem utišanje gena. Vnos siRNA v sesalsko kultivirano celico je lahko direkten ali pa posreden z shRNA. siRNA pridobimo na več načinov: s kemijsko sintezo, z in vitro transkripcijo, z in vitro razgradnjo dsRNA, z ekspresijo iz plazmida, iz shRNA itd. S pomočjo programa za iskanje ustreznih siRNA so izbrali takšni, ki ciljata humano KCMF1 in 14-3-3σ mRNA. Smiselno verigo siRNA so vnesli v siRNA ekspresijske vektorje, s katerimi so nato transfecirali v izvorne celice raka na črevesju, kar je povzročilo utišanje KCMF1 in 14-3-3σ genov. Spremljali so razlike v rasti med transfeciranimi in netransfeciranimi celicami. Transfecirane celice so rastle počasi v primerjavi s kontrolo, po štirih tednih jr bila rast inhibirana.

ZAKLJUČEK Rezultati študije kažejo, da protein 14-3-3σ interagira s KCMF1. Utišanje ekspresije teh dveh proteinov je signifikantno zaviralo celično proliferacijo in nastajanje rakavih celic. Da pa bi bolje razumeli, kako interakcije med proteinoma vplivajo na celično delitev in na rakave celice v črevesju, bodo potrebne še nadaljnje študije.

VIR: Jian Zou, Lin Mi, Xiao-Feng Yu, Jie Dong; Interaction of 14-3-3σ with KCMF1 suppresses the proliferation and colony formation of human colon cancerstem cells; World J Gastroenterol 2013 June 28; 19(24): 3770-3780