ScFv phage display

Seminarska naloga – analiza članka An efficient method for isolating antibody fragments against small peptides by antibody phage display

Zhi Duan and Henrik Siegumfeldt, Combinatorial chemistry & high throughput screening, 2010, 13, 818-828

---

POVZETEK

Cilj članka je bila priprava človeških enoverižnih variabilnih fragmentov (HuscFv) proti trem kratkim peptidom (dolžine dvakrat 15 in enkrat 14 aminokislin) z uporabo predstavitve na nitastih fagih. Peptidi so del αs1-kazeina in vsebujejo prepoznavna mesta za različne encime, ki sodelujejo pri zorenju sira; namen pripravle protiteles je raziskovanje poteka tega pojava. Avtorja sta predstavila težave, s katerimi sta se soočila pri pripravi protiteles – pri immobilizaciji antigenov in pri zmanjševanju nespecifične vezave fagnih delcev. Opisala sta postopke dela, prilagojene za pripravo protiteles proti kratkim polipeptidom in iz knjižnic Thomlinson I in J izolirala visoko specifična protitelesa proti vsem trem antigenom. Ovrednotila sta tudi njihovo vezavo na izvorni in sorodni nativni kazein.

Določitev kapacitete vezave trdnih nosilcev

V začetnem delu postopka obogatitve knjižnice je potrebno na trdni nosilec učinkovite vezati ustrezne antigene. Avtorja sta ob uporabi kratkih peptidov naletela na več ovir. Majhna velikost polipeptidov zmanjša zmožnost vezave na pasivne adsorbente, lahko se pojavijo tudi težave pri kovalentnih vezavah. Njuna tehnika določitve zasedenosti nosilca (vdolbina na mikrotitrski plošči) z antigenom je temeljila na vezavi antigena na nosilec po standardnem postopku. Za tem je sledila vezava pomožnega faga KM13 na isti nosilec. Ti naj bi zasedli vsa preostala prosta mesta, množina vezanega pomožnega faga pa naj bi bila merilo za zasedenost nosilca z antigenom. Kapaciteto vezave sta določila trem trdnim nosilcem z različnimi načini vezave antigena:

   Immo-Strep*: imobilizacija preko vezave biotiniliranih antigenov na imobiliziran streptavidin (pozitivna kontrola – biotin, negativna kontrola - nič)
   Immo-Amino*: kovalentna imobilizacija preko aminskih (in drugih nukleofilnih) skupin (pozitivna kontrola – BSA in kazein (CN), negativna kontrola - nič)
   Maxisorp: pasivna adsorpcija (pozitivna kontrola – BSA in CN, negativna kontrola - nič)
   
   * Osnova aktivne površine je Polysorp (polistiren), zaradi česar so možne tudi nespecifične hidrofobne interakcije

Množino vezanega KM13 so določili po inkubacija s HRP/anti-M13 protitelesi in kromogeni encimski reakcij spektrofotometrično. Izkazalo se je, da je zasedenost nosilca zaradi vezave antigena na Immo-Amino in Maxisorp pod mejo zaznave – rezultati za vse tri antigene se statistično niso razlikovali od negativne kontrole. Nizko zmožnost vezave antigenov na ta dva nosilca so potrdili tudi na koncu z novo pripravljenimi protitelesi proti vsem trem kratkim peptidom – količina vezanih peptidov je bila pod mejo detekcije.

Za razliko od prejšnjih dveh pa je bila zasedenost površine nosilca zaradi vezave antigena v primeru uporabe Immo-Strep enaka pozitivni kontroli (presežni biotin). Za pripravo vseh protiteles, omenjenih v članku, so uporabili ta nosilec.

Rezultati vezave so v splošnem odvisi od antigena. V diskusiji avtorja omenita, da so drugi raziskovalci uspešno uporabili prej omenjene metode za vezavo podobnih antigenov.

Poskus priprave protiteles proti kratkemu peptidu F2

scFv-ji so v knjižnicah Thomlinson I in J predstavljeni kot fuzijski proteini s proteinom pIII. Med fagni protein in scFv je bil vstavljen še c-myc tag, ki vsebuje prepoznavno mesto za tripsin. Aminokislinsko zaporedje proteina pIII pomožnega faga KM13 je bilo spremenjeno tako, da prav tako vsebuje prepoznavno mesto za to proteazo. Elucija vezanih scFv-fagov s tripsinom (TE) tako sprosti fagne delce z zapisi za scFv-je, ki z nosilcem interagirajo preko protiteles. Po inkubaciji s tem encimom pomožni fag ni več zmožen infekcije. Tovrstno elucijo so uporabili v prvotnem postopku selekcije protiteles proti peptidu F2.

Po štirih krogih selekcije in ovrednotenju specifičnosti naključnih 2x96 (knjižnici I in J) scFv-jev nista dobila protiteles, ki bi specifično vezali antigen. Dobila sta več kot sto pozitivnih interakcij z nosilcem , tarče preostalih protiteles pa so neznane.

Ovrednotenje dveh drugih metod elucije

Zaradi negativnih rezultatov z uporabo elucije s tripsinom sta selekcijo na F2 izvedla še z dvema spodaj opisanima metodama elucije:

   kompetitivna elucija (CE): elucija s presežnim antigenom
   
   elucija z naknadno površinsko adsorpcijo (SA): elucija s trietilaminom in naknadna vezava eluata na prost nosilec. Nanj se vežejo protitelesa, ki interagirajo z nosilcem, tista,
   ki vežejo  antigen pa se neovirano sperejo.

Po štirih krogih selekcije na vsak antigen so avtorji testirali specifičnost naključnih 96 klonov . Z uporabo metode kompetitivne elucije sta dobila boljše rezultate. Po analogni metodi obogatitve knjižnic sta avtorja pridobila več kot 120 klonov (ne nujno unikatnih), ki vežejo antigen F2. Tudi elucija z naknadno površinsko adsorpcijo je dala dobre rezultate z uporabo knjižnice Thomlinson J, z uporabo knjižnice I pa zaradi neznanih razlogov rezultate, podobne uporabi elucije s tripsinom. Zaradi tega sta avtorja za pripravo protiteles proti F1 in F3 uporabila le knjižnico J.

Rezultati

Metoda selekcije z uporabo CE je dala pozitivne rezultate za vse tri antigene, proti peptidu F1 je bilo pripravljeno in ovrednoteno eno, proti peptidu F2 dve, proti peptidu F3 pa pet edinstvenih protiteles. Vsem protitelesom proti antigenom je bila tudi določena specifičnost s testom vezave več nespecifičnih tarč (BSA, Gelatin, ostali antigeni) in nekaj pozitivnih tarč (lasten antigen, αs-kazein, soroden kazein). Pripravljeni sta bili tudi dve protitelesi proti Polysorp-u, osnovi trdnega nosilca. Izmed pripravljenih protiteles so tri vsebovala le lahko verigo, kar jih uvršča med enodomenska protitelesa, bolj znana kot nanotelesca.