HMC
Modified handmade cloning HMC - modificirano ročno kloniranje, izumljeno že 2001, so P. Zhang in P. Liu idr. uporabili za produkcijo transgenskih ovc s povišanimi nivoji omega-3 maščobnih kislin. To so prve transgenske ovce narejene s HMC, je pa bila metoda pred tem že uspešno uporabljena.
Omega-3 maščobne kisline so v prehrani zelo pomembne. Idealna dieta naj bi vsebovala veliko višje razmerje omega-3 v primerjavi z omega-6 maščobnimi kislinami, kot jih vsebuje dieta v zahodnem svetu (idealno je 4:1, povprečna prehrana vsebuje 16:1). Večina sesalcev je izgubila sposobnost sintetiziranja omega-3 maščobnih kislin, glista C. elegans pa učinkovito pretvarjanja omega-6 maščobne kisline v omega-3 maščobne kisline z desaturazo, ki je zapisana na fat-1 genu. Fat-1 gen iz C. elegans (1209bp) so zato optimizirali za sesalce. Skonstruirali so evkariontski ekspresijski vektor z genom mfat-1, CAD promotorjem in selekcijskim markerjem za neomicin. Vektor je bil lineariziran in z elektroporacijo transficiran v ovčje fibroblaste kitajske merino ovce. S PCR in RT-qPCR so preverjali prisotnost in nivo mfat-1 mRNA, s plinsko kromatografijo pa so ugotavljali nivoje različnih maščobnih kislin v celicah. Izbrane donorske celice so z metodo HMC združili z brezjedrnimi oocitami ter tako skonstruirali transgenske zarodke.
HMC metoda je zelo podobna že dolgo uporabljani metodi SCNT (somatic cell nuclear transfer), ki pa temelji na uporabi specializiranih instrumentov za mikromanipulacijo.
HMC POSTOPEK: Iz zaklanih živali (ovc) vzamejo jajčnike, iz katerih vzamejo oocite, kulumus celice pa odstranijo z vorteksiranjem. Oocite nato inkubirajo v demecolcinu, zonae pellucidae razgradijo z mešanico proteinaz. Enukleacijo opravijo ročno z ostrim mikrorezilom in zavržejo karioplaste (s kromatinom), citoplaste pa služijo kot receptorske celice – uporabijo 2 brezjedrni oociti za en embrij. Somatske celice druge živali (v tem primeru gensko spremenjene celice) tripsinizirajo in z elektrofuzijo združijo z receptorskimi celicami. Rekonstruirane embrije kemijsko aktivirajo in 7 dni gojijo in vitro. Embriji so bili gojeni v modificiranem Well-of-the-Well (WOW) sistemu, ki je učinkovit pristop za izboljšanje razvoja embriov. Dozorevajo lahko blizu skupaj v stabilnem mikrookolju, kar omogočajo majhne vdolbinice na dnu petrijevke. Po 7 dneh gojenja so zarodke na stopnji blastociste kirurško vstavili v ovce. Skotili so se 3 transgenski jagenjčki, PP-02 je poginil v 48 urah. Skupna učinkovitost: 5,7%. Vsi transgenski jagenjčki so imeli isti genotip in v vseh so dokazali prisotnost mfat-1 gena.
Prisotnost in funkcionalnost mfat-1 gena v transgenskih jagenjčkih je bila potrjena s PCR, RT-qPCR, Southern, Northern in DNA sekvenciranjem. Z BamHI so sekvencirali genom in s Southeren blotom dokazali eno kopijo gena, ki se je vstavila v 5. kromosomu, v intronu funkcionalnega gena za protein Cep120. Za identifikacijo mesta insercije so uporabili TAIL-PCR – Thermal asymetric interlaced PCR. Na jagenjčku PP-02 so s plinsko kromatografijo preverili dejansko učinkovitost desaturaze – vsebnost omega-3 maščobnih kislin v različnih tkivih, ter opazili najvišje nivoje predvsem v skeletni mišici in jeziku, občutno povišani pa so bili tudi nivoji v srcu, vranici in jetrih. Vse n-3 maščobne kisline so konstruirale 6,2% vseh maščob v skeletni mišici (WT: 3,5%). Poskus zaenkrat ni obsegal nadaljnjih raziskav dednosti in stabilnosti mfat-1 gena.
HMC-prednosti: Metodo HMC je dokazano uporabna za več domačih živali – pujsi, govedo. v primerjavi s tradicionalnim kloniranjem HMC radikalno zniža stroške. Poveča produktivnost, omogoča zamrzovanje embriov za shranjevanje, rezultati pri številu rojstev so primerljivi ali celo boljši kot pri tradicionalnem kloniranju. Z avtomatizacijo postopka bi lahko postalo kloniranje bolj množično. Heteroplazmičnost, ki nastane zaradi treh različnih virov mitohondrijev se v praksi še ni pokazala za problematično. Odsotnost zone pellucide kritiki izpostavljajo kot povišano možnost za prenos bolezni, vendar tudi pri SCNT celice niso manj občutljive.
ČLANEK: Zhang P, Liu P, Dou H, Chen L, Chen L, et al. (2013) Handmade Cloned Transgenic Sheep Rich in Omega-3 Fatty Acids. PLoS ONE 8(2): e55941. doi:10.1371/journal.pone.0055941
