Proizvodnja feremonov vešče v rastlinah

ČLANEK: http://www.nature.com/ncomms/2014/140225/ncomms4353/full/ncomms4353.html A plant factory for moth pheremone production

UVOD

Pri uničevanju rastlinskih škodljivcev se za odstranjevanje insektov poleg klasičnih insekticidov v večjih količinah proizvajajo tudi okoljsko prijaznejši sintetični feremoni, ki delujejo tako, da ovirajo običajno komunikacijo pri škodljivcih. Vseeno pa se pri sintezi uporabljajo nevarne kemikalije ali le te nastanejo kot stranski produkt. Rešitev bi bila delno sintetična proizvodnja feremonov s takoimenovano ‘zeleno’ kemijo pri čemer bi z metaboličnim inžinirstvom proces sinteze prenesli v rastline. Ta način pridobivanja feremonov so izvedli na rastlini Nicotiana benthamiana, ki so jo spremenili tako, da je proizvajala feremone za dve vrsti vešč Yponomeuta evonymella in Y. padella. Pri njihovi biosintezi pride do nenasičenja maščobnih kislin, redukcije do primarnih alkoholov in nastanka acetatov ali aldehidov. Pri tem sodelujejo desaturaze in maščobno acilne reduktaze (FAR). Prve proizvajajo nenasičene maščobne kisline različnih dolžin, encimi FAR pa pretvarjajo maščobno acilne spojine v maščobne alkohole. Glavne komponente feremonov pri različnih vrstah vešč so maščobno kislinski acetati, kot so 14:OAc, E11-14:OAc, Z11-14:OAc in Z11-16:OAc. Za njihovo proizvodnjo so v N. benthamiana vnesli vse ustrezne gene. Izvedli so prehodno ekspresijo genov v listih, ki so jo dosegli preko infiltracije z Agrobacterium tumefaciens.

SESTAVA BIOSINTETSKE POTI FEREMONOV VEŠČE

Biosinteza maščobnih kislin se v celicah rastlinskih listov odvija v kloroplastih. Plastidna tioesteraza cepi večino acilnih skupin, ki se nato transportirajo do zunanje membrane kloroplastov, kjer se acilirajo do CoA. Acil-CoA se nato uporabijo pri sintezi lipidov z encimi, ki se nahajajo v ER, kjer pa se nahajajo tudi encimi biosintezne poti feremonov. To dejstvo so izkoristili pri modeliranju pristopa proizvodnje feremonov v listih N. benthamiana. Prvo so v liste N. benthamiana, vnesli plastidno tioesterazo – CpFATB2, ki zaključi biosintezo maščobnih kislin. To stori tako, da hidrolizira tioestersko vez miristoil-ACP (14:ACP), s čimer se poveča količina miristoilne kisline. Slednja se prenese iz kloroplastov v citosol, kjer nastane oblak 14:CoA, ki se nadalnje izkoristi za biosintezo feremonov. V drugem koraku so vključuli Δ11 desaturaze, ki specifično prepoznajo 14:CoA in 16:CoA in proizvedejo (E/Z)-11-tetradecenoil-CoA (E/Z11-14:CoA) in (Z)-11-heksadecenoil-CoA (Z11-16:CoA). V tretjem koraku so vključili encime FAR iz različnih vrst vešč, ki so reducirali E/Z11-14:CoA in Z11-16:CoA v E/Z11-14:OH in Z11-16:OH. V četrtem koraku so vključili še gen za acetiltransferazo (EaDAcT) iz rastlin, ki je prenesla acetatno skupino na primarne alkohole in tako omogočila nastanek E/Z11-14:OAc in Z11-16:OAc. Z omenjenimi encimi so tako skušali proizvesti mešanico feremonov značilnih za vešče vrste Y. evonymella in Y. padella v količinah, ki bi uspešno privabile samce vešče na tarčno polje. Feremoni vrste Y. evonymella in Y. padella imajo različno razmerje acetatov. Tako so liste N. benthamiana infiltrirali z P19, CpFATB2, AveΔ11 in HarFAR, s čimer so dobili mešanico 14 C alkoholov, pri infiltraciji s P19, AtrΔ11 in HarFAR pa so pridobili 16 C alkohole. Alkoholne frakcije iz listov so izolirali in kemično acetilirali. Rastlina, ki je proizvajala 14 C alkohole je proizvedla več kot 500 µg 14 C acetatov ter manjše količine 16:OAc. Rastline, ki pa so proizvajale 16 C alkohole, pa so proizvedle 1280 µg Z11-16:OAc in manjšo količino 16:OAc. Primerjava delovanja sintetičnih feremonov s feremoni iz rastlin, je bila podobna. Feremoni iz rastline so vsebovali iste acetate kot sintetični in manjše stranske produkte. Večina ujetih samcev je bilo vrstno specifičnih tako s sintetičnimi, kot iz rastline dobljenimi feremoni. V primeru Y. padella ni bilo večje razlike med sintetičnimi in iz rastline dobljenimi feremoni, pri Y. evonymella pa je zmes feremonov iz rastline bila manj učinkovita od sintetičnih.

DISKUSIJA

Privabljanje samcev na mesta, ki so kot vabo imela nastavljene feremone iz rastline je bilo visoko in specifično. Prejšne študije so nakazale, da bi dobili boljše rezultate z uporabo manjšega razmerja izomera E (E11-14:OAc). Večji problem pa predstavlja spreminjanje razmerja acetat/alkohol. Večinsko komponento feremonov predstavlja acetat, medtem, ko bi večje količine alkoholov zmanjšale ali celo zaustavile privabljanje samcev. To pomeni, da mora biti pretvorba alkoholov v acetate popolna. Kot alternativa bi bilo možno kontrolirati sproščanje feremonov iz rastlin, vendar o samem mehanizmu sproščanja iz rastlin ni še veliko znanega. Kljub učinkovitosti prehodne ekspresije pa bi bila potrebna stabilna transformacija, s čimer bi se odstranila potreba po ekspresijskih konstruktih. Na ta način bi pridobili sistem, ki bi čez daljše časovno obdobje proizvajal želeni produkt. Količino produkta bi lahko povečali tudi s spreminjanjem moči promotorjev, kontrolnih elementov in načina indukcije. Možna bi bila tudi vključitev promotorja, ki bi se aktiviral na določeni stopnji razvoja rastline.

ZAKLJUČEK

Z uporabo gensko spremenjenih rastlin je mogoče proizvesti vrstno specifične feremone vešč. Ta način bi predstavljal denarno ugoden način proizvodnje srednje do velike količine feremonov z visoko čistostjo in zmanjšano količino nevarnih stranskih produktov. Sistem se bo izboljšal pri spremembi iz prehodne ekspresije na stabilno transformacijo. Kljub nekaterim problemom bi bil ta način proizvodnje feremonov okoljsko bolj prijazen in ekonomsko pomemben.