Produkcija optično čiste mlečne kisline v sevu enterococcus faecium kaže potencial v biopretvorbi odpadkov kmetijske industrije: fiziološka in proteomska študija

ČLANEK: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614000169

Enantioselective lactic acid production by an Enterococcus faecium strain showing potential in agro-industrial waste bioconversion: Physiological and proteomic studies

UVOD

Zaradi želje po razvoju alternative iz nafte pridelanim umetnim materialom se v zadnjih letih veliko pozornost posveča raziskavam različnim bioplastik. Eni od teh razgradljivih biopolimerov so polilaktidi. Zaradi tega se je močno povečala potreba po proizvodnji monomerne enote tega polimera: mlečne kisline (LA). Eden od problemov je, da je za proizvodnjo polimerov potrebna optično čista mlečna kislina, saj je poli-D-LA amorfna, poli-L-LA pa kristalinična struktura. Proizvodnja mlečne kisline je možna preko kemične sinteze ali pa s mikrobno fermentacijo ogljikovih hidratov. Slednji način ima številne prednosti, saj navadno dobimo optično čistejši produkt, delovna temperatura proizvodnje je nižja, zaradi možnosti uporabe odpadkov kmetijske industrije pa so substrati mnogo cenejši. Za proizvodnjo so najprimernejše mlečnokislinske bakterije, saj je mlečna kislina njihov glavni končni metabolični produkt.

IZBOR SEVA

Pri tej raziskavi so najprej želeli ugotoviti, kateri sev mlečnokislinskih bakterij je najprimernejši za proizvodnjo levosučne oblike mlečne kisline. Na koncu eksponentne faze rasti so določili koncentracije mlečne kisline za vsak sev. Pri tem so z encimskim testom posebej določili koncentracijo levosučne ter desnosučne oblike. Kriterija za najprimernejši sev sta bila dva: koncentracija mlečne kisline ter optična čistost le te. Sev Enterococcus faecium LLAA-1 je najbolj ustrezal tema dvema kriterijema, zato so nadaljne raziskave opravljali na temu sevu.

PROIZVODNJA MLEČNE KISLINE PRI RASTI NA RAZLIČNIH SLADKORJIH

V naslednji stopnji študije so preverili, z uporabo katerega sladkorja je proizvodnja mlečne kisline največja. Bakterije so gojili na kemično definiranem gojišču, ter bogatem gojišču M17. V obeh primerih so mediju dodali glukozo, fruktozo, celobiozo ali ksilozo. Pri mediju M17 so preverili tudi, ali dodatek natrijevega acetata poveča produkcijo mlečne kisline. Po pričakovanju so bakterije v M17 gojišču dosegle višjo optično gostoto, ter višjo produkcijo mlečne kisline, kot bakterije v definiranem gojišču. Glukoza ter fruktoza sta dala najboljše rezultate, pri ksilozi pa sta bila rast ter produkcija zelo nizki. Dodatek natrijevega acetata ni izboljšal produkcije mlečne kisline. Še več, v primeru glukoze in celobioze jo je celo zmanjšal.

VPLIV KISIKA NA PROIZVODNJO MLEČNE KISLINE

Preverili so rast celic ter produkcijo mlečne kisline v aerobnih ter anaerobnih pogojih. Pri tem so uporabili bogato gojišče z dodatkom fruktoze. Porabo fruktoze ter produkcijo mlečne kisline so spremljali s HPLC. Ugotovili so, da je rast v aerobnih in anaerobnih pogojih primerljiva. Končna optična gostota pri aerobnih pogojih je manj kot 10% višja kot pri anaerobnih pogojih, kar ni bilo pričakovano, saj ima navadno kisik inhibitorni učinek na rast mikroaerofilnih mlečnokislinskih bakterij. Produkcija mlečne kisline se je močno razlikovala v različnih pogojih. V aerobnih pogojih je bila skoraj 3x večja kot v anaerobnih pogojih. Bila je znatno višja, kot bi bila največja teoretična produkcija ob porabi vse fruktoze, kar kaže na to, da pride v aerobnih pogojih do aktivacije alternativnih metabolnih poti, ki vodijo v produkcijo mlečne kisline. Substrat pa so najverjetneje proteini.

PROTEOMSKA ANALIZA

Da bi ugotovili, kaj je razlog za različno obnašanje celic v aerobnih in anaerobnih razmerah, so se odločili izvesti proteomsko analizo. Iz celic na začetku stacionarne faze so izolirali proteine, ter izvedli 2D elektroforezo. Proteine, pri katerih je bil nivo izražanja različen, so identificirali z MALDI TOF masno spektrometrijo. Različno se je izražalo le 17 proteinov, ki so jih razdelili v 3 skupine: proteine energetskega metabolizma, proteine stresnega odziva ter ostale proteine. V aerobnih pogojih se poveča izražanje komponent piruvat dehidrogenaznega kompleksa. Ker ta encimski kompleks usmerja piruvat v smer sineze acetil-CoA, in ne mlečne kisline, je to še en indikator, da je razlog za višjo produkcijo mlečne kisline pretvorba nekega drugega substrata, in ne fruktoze. Eden od proteinov, ki ima povišano izražanje v aerobnih pogojih, je podenota alkil hidroperoksid reduktaze. Ta protein ima glede na homologijo najbrš NADH oksidazno aktivnost, kar poveča oksidativni metabolizem. Tako je razlog za povečano produkcijo mlečne kisline v aerobnih pogojih najbrš kombinacija povečanja fruktoznega katabolizma, ter delno zaradi aktivacije aminokislinskega katabolizma. Aminokislinski katabolizem poda celicam dve prednosti za produkcijo mlečne kisline: nov vir substratov za biosintezo; ter produkcija amoniaka. Slednje je pomembno, saj nevtralizira zakisanje, do katerega bi prišlo, zaradi povečanja sinteze mlečne kisline. Proteini stresnega odziva so imeli povišano raven izražanja v anaerobnih pogojih, kar kaže na to, da je prisotnost kisika ugodna za rast tega seva bakterij. Med ostalimi proteini s spremenjenim nivojem izražanja sta bila 2 proteina, udeležena v sintezo proteinov, ter 3 hipotetični proteini, katerih funkcija ni znana.

ZAKLJUČEK

Številne seve mlečnokislinskih bakterij bi lahko uporabili pri industrijski proizvodnji mlečne kisline, toda enantioselektivnost sinteze ta nabor močno zmanjša. Sev E. faectum LLAA-1 je sposoben proizvodnje velikih količin optično čiste levo-sučne mlečne kisline. Ker zelo verjetno kot substrat lahko uporablja poleg sladkorjev tudi aminokisline, to omogoča, da lahko kot vir ogljika uporabimo ne le polisaharidno biomaso, temveč tudi s proteini bogate odpadke živiljske industrije.

VIRI

1. Pessione, A., et al. (2014), Enantioselective lactic acid production by an Enterococcus faecium strain showing potential in agro-industrial waste bioconversion: Physiological and proteomic studies. Journal of Biotechnology, 173: 31-40