Pridobitev zaščitnega imunskega odziva proti antraksu preko oralne imunizacije z zaščitnim antigenom kot cepivom, pridobljenim na osnovi rastlin

UVOD

Antraks ali vranični prisad je bolezen, ki jo povzroča bakterija Bacillus anthracis. Gre za nalezljivo bolezen, ki običajno prizadene rastlinojede živali, lahko pa tudi človeka. Razširjena je predvsem na kmetijskih področjih Osrednje Azije, Južne Amerike in Afrike. Pri človeku se najpogosteje pojavlja kožna oblika, ki je običajno ozdravljiva, pri drugih oblikah antraksa pa je smrtnost precej visoka. Posebno nevarna je pljučna oblika bolezni, ki nastane zaradi vdihavanja spor te bakterije, prav te pa se uporabljajo kot biološko orožje v teroristične namene.

Cepiva proti antraksu, ki se uporabljajo v veterinarske namene in za zaščito človeka, niso idealna, saj povzročajo neželene stranske učinke, niso cenovno ugodna in omogočajo le sistemsko imunost. Prav tako cepljenje živali predstavlja nevarnost za človeka, ko gre za divje in potencialno že okužene živali. Alternativo klasičnim cepivom predstavljajo cepiva, ki temeljijo na oralni aplikaciji. Lahko gre za transgene rastline, ki vsebujejo in izražajo gen za določen antigen in po užitju pri človeku ali živali spodbudijo ustrezen imunski odziv.

V raziskavi, ki jo obravnava članek, so pripravili transgene linije Indijske ogrščice (Brassica juncea) in tobaka, ki so vsebovale gen za 'zaščitni antigen' (protective antigen, PA). Gre za poglavitno imunogeno komponento tridelnega toksina antraksa. Cepiva, pripravljena na osnovi užitnih rastlin olajšajo dostavnost živalim in ljudem, so cenejša, varnejša in poleg sistemske imunosti omogočajo tudi prisotnost protiteles v sluznicah.

POTEK DELA

Gen za PA so s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi pomnožili iz plazmida pXO1 (naravni plazmid B. anthracis) in ga klonirali v vektorja pCHV-RKB in pBIN. Prvi vektor je omogočal mestospecifičen vnos gena v kloroplaste tobaka, transformacijo pa so dosegli z metodo biolistike. Transgeno Indijsko ogrščico so pripravili s pomočjo drugega vektorja in z Agrobacterium posredovano transformacijo. Vključitev transgena v genom rastlin so preučevali z metodo PCR ter s prenosom Southern.

Iz listov transgenega tobaka in ogrščice so nato izolirali vse topne proteine, naredili prenos Western, prisotnost PA pa so dokazovali s specifičnimi anti-PA protitelesi. Funkcionalno aktivnost PA so preverili z in vitro citotoksičnim testom na makrofagih, ki so jih inkubirali z PA skupaj z funkcionalnim proteinom toksina antraksa (lethal factor, LF).

Sledili so poskusi na miškah BALB/c. Poskuse do izvedli na 11 skupinah mišk, vsaka pa je vsebovala 5-6 miši. Miši so imunizirali z določeno količino PA, dobljeno iz ogrščice oz. tobaka ter z rPA (rekombinanti PA, pridobljen iz E. coli). Ag so v miške vnesli intraperitonealno (i.p.), oz. so živali hranili z listi transgenih rastlin, pri čemer so določene skupine imunizirali ob uporabi enega izmed dveh adjuvansov (alhidrogel (Al) ali toksin kolere (CT)), pri drugih pa adjuvansov niso dodali. Miške so imunizirali ob dnevih 0, 7, 14 in 28, zadnjo poživilno dozo pa so prejele na dan 175. Pred vsako ponovno imunizacijo so miškam odvzeli krvne vzorce in vzorce blata ter s pomočjo testa ELISA določili titer prisotnih anti-PA protiteles razredov IgG1, IgG2a in IgA. Nevtralizacijo učinkovitost protiteles so testirali tako, da so jih inkubirali s pridobljenimi PA (skupaj z LF), inkubacijsko mešanico pa testirali na makrofagih.

V zadnji stopnji so preverili učinkovitost imunskega odziva testnih mišk. Miškam so i.p. aplicirali določeno količino vegetativnih celic B. anthracis na dan 189 in jih opazovali še mesec dni, v kolikor so preživele.

REZULTATI

Metodi PCR in Southern sta potrdili vključitev transgena v genom rastline, v primeru tobaka so dokazali mestospecifično vgraditev gena v DNA kloroplastov. Prenos Western in uporaba specifičnih anti-PA sta dokazala prisotnost PA v proteinskem izolatu.

In vitro citotoksični testi so dokazali biološko aktivnost PA. V primeru vzorcev PA, izoliranih iz ogrščice, je toksin liziral 26-81 % makrofagov, v primeru vzorcev PA iz tobaka pa 93-96 %. S testom ELISA so pokazali, da so bila anti-PA protitelesa prisotna tako v serumu kot vzorcih blata. Najvišje titre za protitelesa razreda IgG so zaznali v primeru mišk, imuniziranih i.p. z rPA ob dodatku adjuvansa Al, titri pri ostalih skupinah mišk pa so bili le nekoliko nižji. Titri za protitelesa razreda IgA so bili signifikantno nižji kot titri za protitelesa razreda IgG. Nevtralizacijski test je pokazal, da so bila protitelesa pridobljena po oralni imunizaciji sposobna nevtralizirati toksin.

V končnem poskusu, kjer so miškam aplicirali vegetativne celice B. anthracis, so jih 14 dni opazovali na vsake 3-4 ure. Vse kontrolne miške so umrle po treh dneh. Miške, ki so jih imunizirali z rPA z dodanim adjuvansom Al, so pokazale 100 % preživelost. Pri vseh preostalih skupinah pa je bila preživelost 60-80 %.

DISKUSIJA

V raziskavi so torej uspešno izrazili gen za PA v Indijski ogrščici in tobaku in dosegli imunsko zaščito pri miškah, ki so se prehranjevale s temi rastlinami. Miške so pokazale visok titer anti-PA protiteles v serumu, kar kaže na učinkovitost takega sistema. Prav tako so zaznali prisotnost Ab razreda IgA v vzorcih blata, kar kaže na to, da lahko z oralno imunizacijo pri miškah zagotovimo tudi zaščito sluznic. Sekretorna IgA so namreč izrednega pomena pri vdihavanju celic B. anthracis in odpornosti na bolezen, predvsem smrtonosne pljučne oblike. V raziskavi so pokazali tudi, da lahko uporaba adjuvansov pripomore k boljšemu imunskemu odgovoru tudi v primeru oralne imunizacije.