Molekularni vidiki koronavirusov

Uvod

Koronaviruse prištevamo k družini ssRNA (+) viusov Coronaviridae. So družina podobnih virusov, ki primarno okužijo ptice in sesalce, vključno z ljudmi in netopirji. Razvrščeni so v štiri rodove – alfa-, beta-, gama- in deltakoronavirusov. Znanih je 7 koronavirusov, ki lahko okužijo človeka in sicer iz rodov alfa- in betakoronavirusov. V zadnjih dveh desetletjih sta dva visoko patogena virusa rodu betakoronavirusov povzročila dva velika izbruha pandemije - in sicer SARS-CoV leta 2002 (severe acute respiratory syndrome coronavirus) in MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus) leta 2011 .

Vstop virusa v celico

Virusni delec SARS koronavirusa je sferične oblike s premerom približno 120 nm. ssRNA (+) virusni genom skupaj z N proteinom tvori nukleokapsido, ki jo dodatno ovija lipidni dvosloj. V njem najdemo tri skupine membranskih proteinov, proteine S (bodica), M (membrana) in E (ovojnica). Vsaka podenota homotrimernega S proteina je sestavljena iz dveh domen, S1 in S2. S1 vsebuje receptor – vezavno domeno (RBD) in interagira z gostiteljskim receptorjem, medtem ko S2 sproži fuzijo membran, da virusu omogoči vstop v celico. Fuzija zahteva predhodno proteolitično cepitev na dveh mestih S proteina. In sicer na meji S1 / S2 in mestu S2’. Pri virusih SARS-CoV in SARS-CoV-2 se S proteini vežejo na gostiteljski receptor ACE2 (angiotenzin-pretvorbeni encim 2). ACE2 je peptidaza na celični površini, ki se izraža zlasti v epitelijih pljuč in tankega črevesa. Po vezavi na receptorje ACE2 se S proteini cepijo in aktivirajo s proteazo TMPRSS2 na površini celice, kar vodi do fuzije membrane. S proteini virusa MERS-CoV-a pa se vežejo na receptor DPP4. SARS-CoV in MERS-CoV lahko izkoriščata tudi endocitozo za vstop v celice. Vendar v primeru nizke izraženosti katepsinov, virus ni sposoben okužiti celice, saj ti omogočajo njegovo aktivacijo znotraj celice. Način vstopa virusa je odvisen od gostiteljske celice in od tega, če je virus že aktiviran oz. cepljen s proteazami.

Organizacija genoma, sinteza poliproteinov in proteoliza

Koronavirusi imajo enega izmed največjih znanih ssRNA(+) genomov med RNA virusi, ki kodira 22-29 proteinov in je dolg približno 27-32 kb. Translacija genomske RNA poteče branjem ribosoma. Nastanek več proteinov dosežejo s tako imenovanimi poliproteini, ki se cepijo na več manjših proteinov ter s sintezo sub-genomske mRNA s pomočjo premikanja bralnega okvirja. Vsi virusni nestrukturni proteini (nsp) so kodirani v dveh odprtih bralnih okvirih (ORF1a in -b), ki zajemata približno prvi dve tretjini virusnega genoma. ORF1a / -b se prevede v krajši poliprotein pp1a (vključuje nsp 1-11) in daljši poliprotein pp1ab (vključuje nsp 1-16). Premik bralnih okvirjev se zgodi v območju med ORF1a in -1b tik pred stop kodonom, kar omogoči nastanek večjega poliproteina pp1ab. Sproži pa ga prisotnost zaporedja UUUAAAC in se zgodi v 20-50 % primerih. Nastala pp1a in pp1ab se predelata v virusno polimerazo (RdRp) in druge nestrukturne proteine, ki sodelujejo pri sintezi RNA. Strukturni proteini se sintetizirajo iz zapisov na subgenomski mRNA.

Replikacija in izražanje genov

Takoj po vstopu virusa v celico se lahko začne translacija (+)ssRNA deluje kot mRNA. S proteolitično cepitvijo nastali nsp-ji, se združijo in tvorijo replikacijsko-transkripcijski kompleks (RTC), ki sodelujejo pri replikaciji genoma. Podobno kot pri drugih (+)ssRNA virusih tudi podvojevanje koronavirusov vključuje sintezo komplementarne negativne verige RNA, ki služi kot matrica za nastanek pozitivnih verig. Za pomnoževanje virusne RNA je potrebna transkriptaza (od RNA odvisna RNA polimeraza).

Replikacijsko-transkripcijski kompleks (RTC)

Replikacijo, diskuntinuirno transkripcijo in procesiranje RNA upravlja sofisticiran multiproteinski replikazni kompleks (RTC) sestavljen iz več nestrukturnih proteinov. Pri koronavirusih zaradi velikosti genoma slednji spominja na replisome značilne za DNA organizme in vključuje:

• od RNA odvisno RNA polimerazo – RdRp (nsp12)

• faktorje procesiranja (nsp7-8)

• helikazo (nsp13)

• vezavne proteine za enovijačno verigo

• eksonukleazo za kontrolno branje (nsp14)

• kofaktorje (npr. nsp7, nsp8, nsp10)

• encime za dodajanje kape (npr. nsp16)

Mehanizmi popravljanja RNA

Za ohranjanje celovitosti genoma imajo ti virusi, za razliko od RNA virusov s krajšimi genomskimi zaporedji, posebne mehanizme uravnavanja mutacij. In sicer so sposobni kontrolnega branja, kar vrši eksonukleaza nsp14. Tako je stopnja mutacij za nekaj velikostnih redov nižja. Katalitično aktivnost nsp14 spodbuja kofaktor nsp10. Pri RNA virusih je pogosta tudi rekombinacija. Pri koronavirusih do nje pride med sintezo subgenomskih RNA in lahko privede do pomanjkljivih kopij RNA ali do novih (rekombinantnih) lastnosti (npr. možnost replikacije v novem gostitelju).

Procesiranje virusne RNA

K procesiranju koronavirusne RNA prištevamo dodajanje kape na 5' konec in poliadenilacijo na 3' koncu. Dodajanje kape poteka po znani kanonični poti in je pomembno za stabilnost genoma, iniciacijo translacije in preprečevanje delovanja prirojenega imunskega sistema (končna O-metilacija z nsp16). Natančen mehanizem poliadenilacije medtem ni poznan. Ravno tako ni znano, če ta proces nadzoruje RdRp oziroma je potrebna poli(A) polimeraza gostiteljske celice. Sicer pa dolžina poliA repa regulira uspešnost translacije in je sam po sebi nujen za sintezo negativne verige RNA.

Replikacijsko-transkripcijski kompleks kot tarča za zdravila

Najpomembnejša tarča za zdravila je RdRp, ker gostiteljske celice ne vsebujejo njej homolognega encima. Polimerazni inhibitorji so nukleozidni analogi, ki posnemajo trifosfate. Primera sta remdesivir, analog adenozina (odporen na delovanje eksonukleaze), in favipiravir, analog purinov.

REPLIKACIJA KORONAVIRUSOV V MODIFICIRANIH MEMBRANAH

Koronavirusna okužba vodi do spremembe membrane endoplazemskega retikuluma (ER) ob nastajanju RTC. Iz ER izhajajo vezikli z dvojno membrano, v kateri so zasidrani RTC-ji, in se kopičijo ob jedru. Tako so proteini odgovorni za replikacijo bolj skoncentrirani in zaščiteni pred prepoznavo imunskega sistema. Notranja membrana je zaprta, zunanja pa tvori mrežje s sosednjimi membranami in modificiranimi membranami ER. V notranjosti so lokalizirali dsRNA domnevno virusnega izvora. Mesto replikacije znotraj membran pa še ni znano.

Pakiranje in izstop virusa iz celice

Virusni proteini vgrajeni v ovojnico (M, E in S) se prevedejo v ER in zadržijo na mestu brstenja v ERGIC mrežju (cevasto-vezikularni predelek med endomplazemskim retukulumom in Golgijevim aparatom). Mesto replikacije genoma v RTC pa je drugje v celici. Nukleokapsidno jedro z genomom potuje od RTC do ERGIC predelka, kjer se združi z membranami vezikularnega mrežja, katerega del so proteini M, E in S. Slednji tako postanejo del lipidne ovojnice. Sestavljen virion nato zapusti celico po eksocitotski poti.

Akcesorni proteini in patogenost virusa

Koronavirusi ob infekciji vplivajo na celično okolje in ga priredijo, da je za njihovo razmnoževanje bolj ugodno. To dosežejo prek spreminjanja signalnih poti gostiteljske celice, manipulacije ekspresije genov in manipulacije imunskega odziva gostitelja. Kot pomembni regulatorji so se izkazali akcesorni (pomožni) proteini. Najbolj raziskani so pri SARS-CoV, pri katerem niso esencialni za nastanek virusa, a imajo vlogo pri patogenosti in naj bi sodelovali pri interakciji virusa z gostiteljem, proliferaciji celice, programirani celični smrti, proizvodnji vnetnih citokinov in interferonski signalizaciji. Akcesorni proteini niso podobni ostalim proteinom posameznega virusa, tudi znotraj družine koronavirusov se zelo razlikujejo, kar povezujemo z različno patogenostjo.

ZAUSTAVITEV GOSTITELJA (HOST SHUTOFF)

Koronavirusi prisilijo gostiteljsko celico, da vso svojo energijo in material porabi za sintezo virusov. Inhibirajo celično ekspresijo genov in preprečijo sintezo gostiteljevih proteinov ter preusmerijo celico v ekspresijo virusnih genov. Poleg večje količine virusnih proteinov pa se tako tudi zaščitijo, saj omilijo protivirusni gostiteljev obrambni mehanizem, imenovan tudi host shutoff. Pomembno vlogo pri tem ima virusni protein nsp1, ki posredno povzroči cepljenje mRNA, najverjetneje kar z gostiteljevimi lastnimi endonukleazami, preprečuje pa tudi translacijo gostiteljeve mRNA z represijo 40S podenote ribosoma. MERS-CoV deluje malo drugače kot ostali koronavirusi in ustavlja transkripte iz jedra ter spušča naprej le virusno RNA.

Nasprotovanje imunskemu sistemu

Virus se mora tudi zaščititi pred napadi gostitelja, saj s prisotnostjo sproži različne odzive imunskega sistema. Pokazalo se je, da pri okužbi s SARS-CoV-2 ne pride do ojačitve protivirusne interferonske poti, kot bi pričakovali, saj interferoni sodelujejo v protivirusni obrambi in sprožitvi imunskega odziva. Do tega ne pride, ker ima virus več različnih antagonistov specifično za to pot, kot so PLpro, nsp1, ORF3b, N, M, ORF6. Prav tako virus antagonistično zavre vzorčno prepoznavne receptorje in njihove signalne poti, ki v normalnem stanju prepoznajo določene strukture značilne za mikroorganizme in sprožijo prvi napad imunskega sistema z aktivacijo fagocitnih celic. Koronavirusi znižajo sposobnost sprožitve imunskega sistema ob prisotnosti virusne dvoverižne RNA, tako da jo zapakirajo v dvojno membranske vezikle, kjer je prisoten tudi replikacijski-transkripcijski kompleks. Nasprotno pa virus omogoči, da je ob okužbi prisotno veliko protivnetnih citokinov in kemokinov, kar privede do kopičenja vnetnih monocitov, makrofagov in nevtrofilcev v pljučih, kot obrambni odziv telesa, kar pa lahko povzroči poškodbe pljučnega tkiva, puščanje žil in brazgotinjenje pljuč. Koronavirusi vplivajo na MAPK signalno pot, kar lahko dodatno povzroča poškodbe pljuč in smrt. Gostitelj se pred patogenom ščiti s sprožitvijo programirane celične smrti, nekroptozo ali piroptozo, ki pa lahko dodatno povzročata težave z dihanjem. Koronavirusi lahko sprožijo tudi apoptozo, a se ne ve ali je to taktika izogiba imunskega odziva, način povečanja okuženost ali posredna posledica replikacije. Gostitelj tvori nevtralizacijska protitelesa in spominske celice, kot dolgoročno obrambo, a ta po nekaj letih ni več signifikantna.

Viri

1. Hartenian E, Nandakumar D, Lari A, Ly M, Tucker JM, Glaunsinger BA. The molecular virology of coronaviruses. J Biol Chem. 2020.;295(37):12910–34.

2. V’kovski P, Kratzel A, Steiner S, Stalder H, Thiel V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 2021.;19(3):155–70.

3. Liu DX, Fung TS, Chong KKL, Shukla A, Hilgenfeld R. Accessory proteins of SARS-CoV and other coronaviruses. Antiviral Res. 2014.;109(1):97–109.

4. Zhu Z, Lian X, Su X, Wu W, Marraro GA, Zeng Y. From SARS and MERS to COVID-19: A brief summary and comparison of severe acute respiratory infections caused by three highly pathogenic human coronaviruses. Respir Res. 2020.;21(1):1–14.