Razvoj novega dostavnega sistema za gensko zdravljenje cistične fibroze

From Wiki FKKT
Revision as of 22:50, 19 December 2016 by BojanaLazovic (talk | contribs) (New page: iGEM 2016 team Tel-Hai: Development of a novel and efficient delivery-system for gene editing technology in Cystic Fibrosis [http://2016.igem.org/Team:Tel-Hai/Notebook]. == Povzetek == Ci...)
(diff) ← Older revision | Latest revision (diff) | Newer revision → (diff)
Jump to navigationJump to search

iGEM 2016 team Tel-Hai: Development of a novel and efficient delivery-system for gene editing technology in Cystic Fibrosis [1].

Povzetek

Cilj iGEM ekipe Tel-Hai je bil najti način za popolno ozdravitev redke genske bolezni cistična fibroza. Ta namen so nameravali izpolniti s pomočjo genskega zdravljenja, ki bi popravilo mutacijo na genu za transmembranski regulator prevodnosti cistične fibroze. Gre za gen, ki je v primeru mutacije odgovoren za nastanek te bolezni. Kot orodje za popravljanje DNA so izbrali tehnologijo CRISPR/Cas. Ključna tema njihovih raziskav pa je bil dostavni sistem plazmida z zapisom za CRISPR/Cas do tarčnih celic. Na podlagi dosedanjih podatkov, ki so jih našli na to temo so se odločili, da bodo kot transporter uporabili podenoto B toksina kolere. Gre za netoksično podenoto, ki se zelo specifično veže le na epitelijske celice, ki pa so pri cistični fibrozi najbolj prizadete. Proteinsko podenoto so s proteinom poskusili povezati na dva načina, s kemijsko vezjo in preko dodatne DNA vezavne domene. Rezultati so pokazali, da je DNA vezavna domena primernejša. Najnižji koncentraciji pri katerih je prišlo do popolne vezave sta bili 400ng DNA s 300ng proteina. Preizkusili so tudi ali se dobljeni kompleks dejansko pripne na membrano in preide v celico. Rezultati obeh eksperimentov so bili pozitivni, razvidni pa so iz slik, ki so jih dobili na konfokalnem mikroskopu.

Uvod

Cistična fibroza

Cistična fibroza (CF) je avtosomsko recesivna genska bolezen, ki jo povzroči mutacija na genu za transmembranski regulator prevodnosti cistične fibroze (CFTR - cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). V 66 – 70 % jo povzroči delecija treh nukleotidov na ΔF508, kar pomeni izgubo amino kisline fenilalanin na 508 mestu v proteinu. Poleg omenjene, obstaja še 1500 ostalih mutacij, ki vodijo do CF in vsak 25 človek je nosilec katere izmed njih. Bolezen prizadene eksokrine žleze, ki izločajo sluz zlasti v dihalnih poteh. Pacienti imajo najbolj prizadeta pljuča, pa tudi trebušno slinavko (pankreas), črevesje, ledvice, jetra in žleze znojnice. Bolniki imajo težave z dihanjem in zaradi pogostih infekcij na pljučih izkašljujejo sluz. Poleg tega imajo med drugim pogoste infekcije sinusov, mastno blato, so nižje rasti, moške pa v večini primerov prizadene neplodnost. Trenutno obstajajo le zdravila, ki zdravijo simptome CF, ne pa tudi taka, ki bi bolezen pozdravila. Pljučne infekcije zdravijo z antibiotiki, ki jih pacienti zaužijejo, inhalirajo ali prejmejo intravenozno. Dnevno bolniki zaužijejo 50 – 80 zdravil, se udeležujejo fizioterapije, ki olajša delovanje pljuč in inhalacijskih zdravljenj, ki olajšajo dihalno stisko. Vsakih nekaj mesecev pa so tudi hospitalizirani. Zaradi odkritih zdravil življenjska doba pacientov s CF z leti narašča, a še vedno znaša le okoli 40 let.

CRISPR/Cas sistem <ref name="Peng, Lin, and Li 2015">Peng, Rongxue, Guigao Lin, and Jinming Li. 2015. “Potential Pitfalls of CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing.” FEBS Journal: n/a-n/a.</ref> <ref name="Xiao-Jie et al. 2015">Xiao-Jie, L. et al. 2015. “CRISPR-Cas9: A New and Promising Player in Gene Therapy.” Journal of Medical Genetics 52(5): 289–96.</ref>

CRISP/Cas je del imunskega sistema prokariontov, ki skrbi za imunsko odpornost pred tujimi genetskimi elementi. CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) so gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev v genomih bakterij in arhej. Cas (CRISPR-associated protein) pa so s CRISPR – povezani geni, ki se v naravi nahajajo na istem lokusu kot CRISPR. Po raziskavah tega sistema so znanstveniki odkrili, da ga lahko z ustrezno manipulacijo uporabljamo za spreminjanje katerega koli gena in je danes ena vodilnih tehnik v ta namen. Za urejanje genoma s CRISPR Cas9 potrebujemo le dve molekuli, protein Cas9 in sgRNA (single guide RNA). Ob vstopu nukleaze Cas9 in sgRNA v jedro, se Cas9 s pomočjo RNA veže na izbrano mesto v celici. Ob tem se lahko izbrani del obstoječega gena odstrani in/ali zamenja z novim zaporedjem odvisno od načina na kateri izvedemo postopek. Ta metoda dobro deluje v celičnih kulturah in bi z njo lahko dokaj enostavno popravili CFTR.

Toksin kolere <ref name="Baldauf et al. 2015">Baldauf, Keegan J., Joshua M. Royal, Krystal Teasley Hamorsky, and Nobuyuki Matoba. 2015. “Cholera Toxin B: One Subunit with Many Pharmaceutical Applications.” Toxins 7(3): 974–96.</ref> <ref name="Bharati and Ganguly 2011">Bharati, Kaushik, and Nirmal K. Ganguly. 2011. “Cholera Toxin: A Paradigm of a Multifunctional Protein.” Indian Journal of Medical Research 133(2): 179–87.</ref> <ref name="Kuziemko, Stroh, and Stevens 1996">Kuziemko, Geoffrey M., Mark Stroh, and Raymond C. Stevens. 1996. “Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance.” Biochemistry 35(20): 6375–84.</ref> <ref name="SPANGLER 1992">SPANGLER, BD. 1992. “STRUCTURE AND FUNCTION OF CHOLERA-TOXIN AND THE RELATED ESCHERICHIA-COLI HEAT-LABILE ENTEROTOXIN.” MICROBIOLOGICAL REVIEWS 56(4): 622–47. http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=20&SID=R2gWhzie4SJJYR5rFhE&page=1&doc=10.</ref>

Toksin kolere je sestavljen iz podenot A (CTA) in B (CTB). CTA je odgovorna za toksični vpliv encima na telo, podenota CTB pa za transport toksina v celico. Za CF bi bila primerna izbira uporaba CTB, ker je le ta visoko specifična za epitelijske celice. Pri CF pa so mutirane ravno te. CTB se veže na gangliozidni receptor (GM1) na epitelijskih celicah. Za dostavni sistem je CTB primeren, ker je stabilen v človeškem telesu, vključno s prebavnim traktom, je specifičen in ni toksičen.

Dostavni sistem

Ekipa Tel Hai si je zamislila dva načina povezave plazmida s CRISPR/Cas in toksinom kolere (CT) oz. toplotno labilnim toksinom (LT - Heat-Labile Toxin) – analogom CT v E. coli.

Kemijska vezava

Kemijska vezava temelji na povezavi aminokislin s karboksilnimi ostanki na toksinu kolere (CTB), z aminskimi skupinami nukleotidov na plazmidu. Reakcija, ki omogoča to vezavo poteka tako, da se najprej kemijski linker 3–amino-1,2-propanediol z nukleofilno reakcijo poveže s karboksilnimi aminokislinskimi ostanki na toksinu. Po tem oksidiran toksin zmešamo s plazmidom in tvori se iminska vez ki povezuje protein z DNA. Taka vezava je pH nestabilna in ob prihodu v celico razpade, tako da lahko plazmid prosto potuje do jedra.

DNA vezavna domena

DNA vezavna domena (DBD) je proteinska domena, ki vsebuje vezavni motiv za dvojno ali enojno DNA vijačnico. DBD lahko prepozna specifično zaporedje DNA ali pa ima splošno afiniteto do DNA. Nanjo se lahko veže, ker vsebuje peptid, ki ima pozitivno nabito aminokislinsko zaporedje. Nekateri virusi imajo proteine, ki že v osnovi vsebujejo DBD domene, a v skupini so se odločili za fuzijski protein. Izbrali so obstoječ plazmid, ki vsebuje zapis za fuzijski protein, ki povezuje LTB z DBD (LTBD). Tak himerni protein se lahko v nadaljevanju poveže z DNA.

Prednost opisanih dostavnih sistemov je ta, da bi take komplekse lahko uporabili kot dostavni sistem tudi pri drugih ciljnih tarčah CRISPR/Cas sistema, kot npr. RNAi molekulah, tumor supresorskih genih in imunogenskih epitopih pri terapiji raka. Zaradi specifičnosti CTB na epitelne celice, pa bi bil sistem primeren tudi za zdravljenje drugih bolezni, ki prizadenejo te celice kot nor: psoriaza, viltigo in različne vrste raka.


Rezultati

Skupina si je zastavila 5 ciljnih problemov, ki so jih nameravali dokazati. Vsi so povezani z dostavnim sistemom, ki bi v celico pripeljal plazmid z zapisom za CRISPR/Cas. Kljub temu, da so v uvodu omenili, da bi za dostavni sistem uporabili CTB, so se v eksperimentih za začetek osredotočili na bakterijski toksin LTB. Namesto plazmida s CRISPR/Cas pa so zaradi lažje identifikacije uporabili plazmid z zelenim fluorescirajočim proteinom (GFP)

Povezava LTBD + s plazmidno DNA

Povezava LTBD z DNA je bila uspešna. Koncentracija, pri kateri se je na protein vezalo vseh 400 ng DNA je bila 300 ng. Vezavo so dokazali s pomočjo gelske elektroforeze. Ko so nanjo nanesli kompleks DNA in proteina, ki se je vezal DNA ni več mogla potovati po gelu. Poizkusili so tudi kemijsko povezati CTB s plazmidom, a vezava ni bila najbolša. To je bil tudi razlog ta so prešli na LTBD.

Vezava LTBD na gangliozidni receptor

Pokazali so da je bila vezava na celično membrano uspešna, ne pa ali se je LTBD vezal prav na gangliozidni receptor. To so dokazali s pomočjo kupljenega LTBD proteina, ki je bil pobarvan s FITC. FITC je fluorescirajoča molekula zato so lahko pod konfokalnim mikroskopom videli, kje se nahaja LTBD.

Vstop kompleksa LTBD in DNA v citosol in vstop plazmida v nukleus

Dokazali so tako vstop kompleksa v citosol, ko plazmida v nukleus. To je bilo mogoče, ker je bil LTBD kompleks obarvan z zelenim FITC, plazmid pa z modrim barvilom Hoaechst in ju je bilo pod mikroskopom mogoče ločiti.

Ekspresija GFP v jedru

Ekspresije GFP v jedru jim zaradi pomanjkanja časa ni uspelo pokazati.

Zaključek in diskusija

Predstavljena ideja je zanimiva, ker predstavlja nov pristop k zdravljenju genskih bolezni. Kljub temu pa ima tudi nekaj pomanjkljivosti, ki bi jih bilo v prihodnosti potrebno rešiti. CTB, ki so ga predlagali kot del dostavnega sistema je zelo imunogena molekula. Njegova večkratna uporaba bi povzročila nastanek protiteles in aktivacijo imunskega sistema. Zato bi bilo potrebno ob uporabi takšnega zdravila zmanjšati aktivnosti imunskega sistema, uporabiti zaščitene molekule ali pa zdravilo vzeti v enkratni dozi. Morda pa bi bila po drugi strani ta imunogenost zanimiva pri zdravljenju raka, saj bi celicam imunskega sistema omogočila lažje prepoznavanje rakavih celic.

Viri

<references />