View source for Razvoj riža za proizvodnjo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.

Norovirus je enoverižni RNA virus brez virusne ovojnice. Okuži lahko različne sesalske organizme in povzroča akutni gastroenteritis (okužbo prebavil). V pogovornem jeziku se za to bolezen pogosto uporablja izraz trebušna gripa, čeprav povzročitelj le-te ni virus gripe. Humani norovirus lahko prizadene ljudi vseh starostnih skupin, ranljive skupine pa so predvsem otroci, starejši in ljudje z oslabljenim imunskim sistemom [1]. Kljub temu, da posledice okužbe po večini niso nevarne (driska, bruhanje, bolečine v trebuhu), po ocenah zaradi te bolezni letno umre med 70.000 in 200.000 ljudi. Človek je dovzeten za okužbo z norovirusi iz skupine GI, GII in GIV, znotraj katerih obstaja veliko genotipov [2]. Prenaša se z okuženim materialom (hrano, pijačo, izločki). Na tržišču trenutno še ni zdravila za zdravljenje in nadzor nad boleznijo [1].

===MucoRice===
Raziskovalci so v rižu vrste japonica (Nipponbare) proizvedli protitelesa proti humanemu norovitusu GII.4 (seva 2006b in Sydney_2012) oziroma GII.17 (sev Kawasaki_2015). To so t. i. VHH protitelesa, kjer gre za variabilno domeno fragmentov težke verige laminih protiteles (VHH - ''a variable domain of a llama heavy-chain antibody fragment''). Z virusom podobnimi delci (VLP – ''virus-like particle'') norovirusa GII.4 oziroma GII.17 so imunizirali lame in tako pridobili več klonov VHH. S predstavitvijo na bakteriofagih pa so izbrali dva klona; 7C6 proti  GII.4 in 1E4 proti GII.17 [1].

===Snovanje in izvedba eksperimenta===
Zasnovana sta bila dva tipa transgenega riža. Prvi je izražal monomerni VHH 7C6 proti GII.4, drugi pa heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17. V obeh primerih so uporabili binarni T-DNA vektor (pZH2Bik45G1B), v katerega so poleg enega oziroma drugega zapisa vstavili tudi konstrukt za RNA interferenco. S tem so v riževih zrnih zmanjšali izražanje prolamina in glutelina, ki sta poglavitna založna proteina, in tako vplivali na visoko vsebnost rekombinantnega proteina v zrnih. Transformacijo riževih rastlin s pripravljenima vektorjema so izvedli z ''Agrobacterium tumefaciens''. Tako vzgojene transgene rastline so rasle pri pogojih: 12 urna fotoperioda, med osvetljenim delom cikla pri 27°C oz. 22°C v nočnem delu cikla. Iz zrn so pripravili riževo moko in s pufrom ekstrahirali vse proteine, nato pa v raztopino PBS ekstrahirali protein VHH. Po centrifugiranju so za nadaljnje eksperimente uporabili riževo vodo (supernatant), kjer se nahaja topen VHH.
* 	Vsebnost akumuliranih VHH so določili z analizo SDS-PAGE (barvanje s Coomassie Brilliant Blue - CBB) in prenosom po Westernu. Intenziteto linij (na gelu oz. membrani) VHH iz riža (monomerni VHH 7C6 oz. heterodimerni VHH 7C6-1E4) so primerjali z intenziteto linij standarda (rekombinantni homodimerni VHH 7C6 in heterodimerni VHH 7C6-1E4). Vzporedno so namreč v celicah ''Escherichia coli'' pripravili tudi dva rekombinantna proteina*, ki so ju izolirali, očistili z uporabo Ni kolone ter uporabili kot standard (njuna koncentracija je bila določena na podlagi teoretične absorbance pri valovni dolžini 280 nm).
:: *V celicah Escherichia coli (Rosetta 2 (DE3) pLysS) proizvedena rekombinantna proteina sta: homidimerni VHH, ki ga tvorita dve VHH 7C6 zaporedji povezani z zaporedjem (GGGGS)3, ter rekombinantni heterodimerni VHH, katerega C konec predstavlja zaporedje 1E4, N konec zaporedje 7C6, povezuje pa ju vmesnik (GGGGS)4. 
* 	Učinkovitost tako proizvedenih protiteles (tistih iz riža kot tudi tistih iz ''Escherichia coli'') so preizkusili na epitelnih črevesnih celicah (pridobljenih iz humanih induciranih pluripotentnih celic) - IEC (''human induced pluripotent stem-cellderived intestinal epithelial cells'').
* 	S primarnimi in konjugiranimi sekundarnimi protitelesi so na rezinah riževih zrn  označili prolamin, glutelin in 7C6 ter z imunofluorescenčno mikroskopijo določili intenziteto fluorescence prolamina in glutelina. Podobno so tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo opazovali porazdelitev VHH ter obeh založnih proteinov v riževih zrnih [1]. 

===Rezultati===
Z analizo intenzitet linij VHH (iz riža) na gelu so ugotovili, da je v povprečju nivo izražanja 7C6 enak 7,17 mg/g riževih zrn, za 7CH-1E4 pa 4,63 mg/g zrn. Povprečen izkoristek topnega 7C6 je znašal 5,39 mg/g riževe vode oz. 2,78 mg/g riževe vode. Učinkovitost ekstrakcije 7C6 oz. 7CH-1E4 s PBS iz riževe moke je bila torej 75,1% oz. 59,9%.
Z imunofluorescenčno mikroskopijo so pokazali, da je prisotnost prolamina in glutelina v riževih zrnih, ki izražajo 7C6 oz. 7C6-1E4, občutno manjša, kar potrjuje učinkovitost RNA interference za zaviranje izražanja teh dve založnih protinov. Slednje so potrdili tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo.
Nevtralizacijska sposobnost v rižu proizvedenih heterodimernih VHH 7C6-1E4 se je izkazala za bolj učinkovito (tako proti norovirusu GII.4 kot proti GII.17) v primerjavi z monomernim VHH 7C6. Vpliv dimerizacije VHH na povečano sposobnost nevtralizacije je potrdil tudi rezultat obeh rekombinantnih proteinov (homodimer 7C6 in heterodimer 7C6-1E4), proizvedenih v ''Escherichia coli''. Učinkovitost obeh je bila namreč večja od monomernega 7C6, proizvedenega v rižu, in primerljiva s heterodiemernim 7C6-1E4, prav tako proizvedenim v rižu. Za slednjega so pokazali, da nevtralizacijsko sposobnost obdrži tudi ob predhodni toplotni obdelavi (90°C, 20 min) [1]. 

===Zaključek===
Kljub manjši ekspresiji heterodimera VHH 7C6-1E4 v riževih zrnih napram monomeru VHH 7C6, je heteordimerni VHH v primerjavi z monomernim izkazoval večjo učinkovitost nevtralizacije norovirusa GII.4_2006b in GII.4 Sydney_2012. Ob enem pa VHH 7C6-1E4 nevtralizira tudi norovirus GII.17 [1]. 
V razvoju so sicer cepiva na podlagi virusom podobnih delcev (VLP) proti GII.4 in GI.1, ne pa tudi proti novim oblikam virusa (GII.17). Prav tako za omenjena cepiva še ni podatka o primernosti njihove uporabe za ranljivejše skupine, za protitelesa VHH pa poročajo o učinkoviti in varni uporabi tudi pri slednjih [3], [4]. V rižu proizveden heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4  in GII.17 tako predstavlja učinkovino, ki je tudi temperaturno in pH stabilna ter zato potencialno primerna za oralno inumoterapijo [1].

===Viri===
[1] Sasou, A. et al. Development of Antibody-Fragment – Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus. Front. Plant Sci. 12, (2021).

[2] Chhabra, P. et al. Updated classification of norovirus genogroups and genotypes. J. Gen. Virol. 100, 1393–1406 (2019).

[3] Moonens, K. et al. Structural insight in the inhibition of adherence of F4 fimbriae producing Enterotoxigenic Escherichia coli by llama single domain antibodies. Vet. Res. 46, 1–7 (2015).

[4] Tremblay, J. M. et al. A single VHH-based toxin-neutralizing agent and an effector antibody protect mice against challenge with Shiga toxins 1 and 2. Infect. Immun. 81, 4592–4603 (2013).