Super tobak

Uvod

Z napredkom industrije v svetu se vedno več soočamo z njenimi posledicami. Slabosti napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,3-trikloropropan (1,2,3-TCP). Letna proizvodnja znaša okoli 50 tisoč ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid (fumigant). Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3-TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.

1,2,3-TCP se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami E. coli na iGEM2013 niso bili uspešni, zato se je ekipa iGEM2017 s kitajske univerze UESTC odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.

Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,3-TCP v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31, BBa_K1199043) iz Rhodococcus rhodochrous in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P, BBa_K2286000) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA, BBa_K2286003), obe izolirani iz Agrobacterium radiobacter AD1.

Konstrukcija poti za razgradnjo 1,2,3-TCP

Vektor, ki bi omogočil razgradnjo 1,2,3–TCP v glicerol, so postopno pripravili v rastlinskem ekspresijskem vektorju piGEM2017, z zapisom za odpornost na kanamicin (NptII).

Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku

Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo peptida 2A in metode Golden Gate so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V četrti vektor so vnesli vse tri gene, v zadnjega pa le dva; dobili so naslednje vektorje: piGEM2017-001 (DhaA), piGEM2017-002 (HheC-W249P), piGEM2017-003 (EchA), piGEM2017-004 (DhaA, HheC-W249P in EchA) ter piGEM2017-005 (DhaA, HheC-W249P)

Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka

1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 (BBa_K2286005) iz Arabidopsis thaliana. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin oksidazo CKX3 (BBa_K2286004), ki z razgradnjo citokinina vpliva na razvoj rastline. S prekomernim izražanjem gena pa bi pospešili razvoj koreninskega sistema in omogočili hitrejšo rast korenin.

Izvencelično izražanje tarčnih genov

Vsi trije encimi opravljajo svojo vlogo zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen (BBa_K2286002), ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za reporterski protein (ß-glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili funkcionalnost multigenskih rastlinskih ekspresijskih vektorjev.

Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin

Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z Agrobacterium. Plazmide so vnesli v Agrobacterium EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po približno desetih tednih so preko rastlinske tkivne kulture (kalusa) dobili transgeni tobak. Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in reakcije PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem z X-gluc. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom GUS, so bile po 24-ih urah obarvane modro.

Rezultati

Za detekcijo aktivnosti multiencimskega sistema in vitro oz. za določitev koncentracij vseh metabolitov razgradne poti 1,2,3–TCP so uporabili plinsko kromatografijo. Na projektu so se osredotočili le na aktivnost encimov v listih.

Aktivnost encimov

Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3–TCP v 2,3-dikloropropan-1-ol (2,3–DCP), je bila po dodatku 5 mM 1,2,3–TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3–DCP niso detektirali. Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in 3-kloropropan-1,2-diola - CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov - epiklorohidrina (ECH) in glicidola (GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna E. coli. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3–TCP. V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila prav tako opazna razgradnja ECH v CPD pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz rekombinantne E. coli, in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,3–TCP v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta, so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.

Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah

Hidroponika je breztalna tehnika vzgoje rastlin, ki temelji na uporabi hranilnih raztopin, bogatih z minerali. S to tehniko so člani ekipe preverili delovanje njihovega »super tobaka« v vodnem okolju. V ta namen so rastline presadili v hranilne raztopine s substratom koncentracije 5 mM. Meritve so pokazale uspešno delovanje DhaA31 in EchA ob dodatku HheC v medij, le pri piGEM2017-004 glicerola ni bilo zaznati, saj se je najverjetneje vključil v rastlinski metabolizem.

Modeliranje

Za natančen vpogled v dinamiko encimskega sistema so sestavili matematični model, postavljen model pa preverili z vstavljanjem eksperimentalnih podatkov, pridobljenih iz znanstvenega članka. Na podlagi rezultatov so nato s pomočjo modela optimizirali sistem in sicer so izbrali ustrezno mutirane encime ter določili njihova optimalna stehiometrična razmerja v vsaki stopnji razgradne poti. Pri tem so upoštevali faktorje, ki otežujejo študije, kot je npr. inhibicija encima z enim od produktov ali afinitet encima do različnih substratov.

Zaključek

Namen projekta iGEM2017 skupine s kitajske univerze UESTC je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo okoljskega onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 (BBa_K1199043) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih konstantah ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi encim HheC (BBa_K2013002), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih halogenidov. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno raziskati tudi delovanje sistema pri tobaku, ki bi ga posadili v kontaminirano zemljo.

(Inge Sotlar)

Viri

- iGEM2017 UESTC-China
- Dvorak, P., Bidmanova, S., Damborsky, J. in Prokop, Z. (2014). "Immobilized Synthetic Pathway for Biodegradation of Toxic Recalcitrant Pollutant 1,2,3-Trichloropropane." Environmental Science & Technology, 48, 6859−6866.