Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

Povzeto po: Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. Microbiol Spectrum. 6, 1–6 (2018).

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA

Salmonella enterica je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v S. enterica patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σ^s. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σ^s faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. Microbiol Spectrum. 6, 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v S. enterici. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence S. enterice, ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V E. coli in V. cholerae je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz E. coli, katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med afaABCD in afaE transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za afaD in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v E.coli je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja nusG in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom kilR iz rac profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja nusG, kar posledično vodi do povečanja izražanja kilR in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. EMBO J. 37, 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s cis-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v E. coli je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo E. coli preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. Escherichia coli responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu D-ksilose (XylR), ter transporterja piruvat kinaze A (PykA) in manoze (ManX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični E. coli, stimulira izražanje flagelina (FliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA fliC, ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto E. coli EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval dpp mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic E. coli spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za lc in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih E. coli okuženih z bakteriofagom Φ24_B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in vb_24B_43. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena d_ant. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira cI represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24_Β. Sci. Rep. 5, (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije Pseudomonas aeruginosa, čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavigne, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12, 1–20 (2016).</ref>

Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba E. coli z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe E. coli z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba P. aeruginosa s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

Viri

<references/>